卵白蛋白（OVA）是蛋清蛋白中含量最高的蛋白質(zhì)（約占54%），由385 個氨基酸組成（分子質(zhì)量為45 kDa），是影響蛋清蛋白加工特性的主要物質(zhì)。蛋白質(zhì)和多糖之間的相互作用強度可以調(diào)控復合體系的結(jié)構(gòu)，進而影響復合體系的透明度、穩(wěn)定性和凝膠特性。巖藻多糖（FUC）是一種天然的硫酸化多糖，具有無毒和高生物相容性的特點，其碳鏈結(jié)構(gòu)主要由含有硫酸基團的巖藻糖殘基組成。FUC是一種高電荷的水溶性陰離子聚合物，在生物學和醫(yī)學領(lǐng)域有著廣泛的應用，OVA/FUC不僅可作為安全、大容量的載體用于靶向給藥，還可作為具有生物活性的營養(yǎng)物質(zhì)使用，在制備蛋白質(zhì)納米顆粒方面表現(xiàn)出充足的潛力。

吉林大學食品科學與工程學院的張婷、袁一心、尚曉敏*等人采用濁度滴定法、Zeta電位測量等分析方法，測定OVA/FUC復合體系在不同蛋白質(zhì)/多糖復配比和鹽濃度下的相行為變化，明確二者復合凝聚的臨界pH值；利用圓二色光譜（CD）、熒光光譜和流變學等手段，解析FUC對蛋白構(gòu)象和物性的影響，闡釋OVA和FUC相互作用的機制。以期為理解硫酸化多糖與蛋白質(zhì)相互作用機制奠定良好理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)基于硫酸化多糖/蛋白質(zhì)復合凝聚體的功能性食品提供理論依據(jù)。

1 OVA/FUC復合凝聚相行為分析

1.1 pH值對OVA/FUC復合凝聚的影響

多糖和蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生復合凝聚現(xiàn)象是由于帶相反電荷的生物聚合物之間的靜電引力驅(qū)動。復合體系的pH值是決定生物聚合物表面電荷密度的關(guān)鍵。如圖1所示，在酸性滴定過程中，OVA/FUC復合物的濁度明顯高于OVA或FUC單一溶液，這主要歸因于靜電引力作用促進了蛋白質(zhì)和多糖之間形成復合凝聚體。在酸滴定過程中單一的FUC溶液相對澄清，其濁度低且相對恒定，這歸因于FUC分子表面的硫酸基團產(chǎn)生了抑制多糖分子間聚集的強靜電斥力。OVA的濁度取決于pH值，在OVA的等電點（pH 4.72）附近達到最大。對于OVA/FUC復合物，有4 個關(guān)鍵的pH值臨界點（pHc、pHφ1、pHmax和pHφ2），pHc為濁度曲線斜率初次變化時的pH值，pHφ1是濁度曲線斜率突然增大時的pH值，pHmax是濁度達到峰值時的pH值，而pHφ2值是濁度曲線下降至穩(wěn)定時的pH值。當pH＞pHc時，OVA與FUC在溶液中都帶負電，由于復合物之間的靜電排斥作用，OVA和FUC之間無法形成復合物（共溶區(qū)）。當pHφ1＜pH＜pHc時，復合溶液濁度開始增加，表明溶液中OVA和FUC形成了具有一定散射光線能力的可溶性復合物。當pH值高于蛋白質(zhì)等電點時，依然可以通過靜電相互作用形成可溶性復合物，這主要是蛋白質(zhì)表面少量帶正電的氨基酸與聚陰離子多糖帶負電的硫酸基團相互作用的結(jié)果，也稱之為“正電補丁”效應。隨著進一步滴定，濁度急劇上升，當pH＜pHφ1時，出現(xiàn)明顯的相分離，形成不溶性復合凝聚體。OVA和FUC之間的靜電相互作用在pHmax時達到最強，導致不溶性O(shè)VA/FUC復合凝聚體的積累量達到最大。而后，隨著pH值的不斷降低，由于多糖的質(zhì)子化，OVA/FUC復合凝聚物開始出現(xiàn)解離，乳濁液逐漸變澄清。但并未觀察到OVA/FUC復合凝聚物完全解離（即未出現(xiàn)pHφ2）。主要原因在于含有硫酸基團的FUC酸解離常數(shù)（pKa）較低，在強酸條件下仍然未被全部質(zhì)子化，因此即便在較低pH值時，OVA與FUC仍然存在強靜電吸引力，較難解離。OVA/硫酸葡聚糖互作體系及OVA/果膠體系在酸化過程中均存在類似現(xiàn)象。

1.2 蛋白質(zhì)/多糖復配比對復合凝聚相行為的影響

蛋白質(zhì)/多糖復配比是影響復合物形成的關(guān)鍵因素之一，對復合體系的臨界pH值影響顯著。本研究進一步探討了無鹽添加條件下OVA/FUC復配比對復合凝聚體形成的影響。如圖2所示，隨著OVA/FUC質(zhì)量比的增加（從1∶1增加至50∶1），OVA/FUC復合體系的濁度曲線逐漸趨于正態(tài)分布（圖2a），臨界pH值向更高pH值遷移（圖2b）。當?shù)鞍踪|(zhì)/多糖質(zhì)量比為1∶1時，復合溶液濁度較低，表明FUC處于過量狀態(tài)，體系內(nèi)蛋白分子可完全結(jié)合到糖鏈上，此時體系靜電斥力較強，進一步抑制了蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)分子相互作用。當?shù)鞍踪|(zhì)/多糖質(zhì)量比從5∶1增加到50∶1時，復合溶液的濁度曲線逐漸呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明在較高蛋白質(zhì)濃度條件下促進了復合凝聚體的形成，此時FUC糖鏈可結(jié)合多個OVA分子。圖2c為不同蛋白質(zhì)/多糖復配比復合凝聚物的外觀，質(zhì)量比為50∶1與20∶1的樣品隨著pH值降低出現(xiàn)了明顯的宏觀相分離，而在5∶1的體系中未觀測到類似現(xiàn)象。相分離由熱力學不相容而產(chǎn)生的排除體積效應影響，而非絮凝作用。綜上所述，當OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1時，OVA和FUC的結(jié)合達到飽和，二者在復合凝聚過程中形成最穩(wěn)定的復合凝聚體。

1.3 離子強度對OVA/FUC復合凝聚的影響

鹽離子可通過靜電屏蔽作用調(diào)控生物聚合物之間的相互作用。本實驗以O(shè)VA/FUC質(zhì)量比20∶1為條件制備復合溶液，分析NaCl濃度對OVA與FUC復合凝聚過程的影響。如圖3a所示，隨著NaCl濃度的增加，復合體系的濁度曲線在pH＜pHmax后逐漸趨于平緩。特別是當鹽濃度大于50 mmol/L時，復合溶液的濁度曲線有一個較寬的平臺期。當鹽濃度大于200 mmol/L時，濁度由于強靜電屏蔽效應而顯著提升，溶液的表觀形貌進一步證明了該變化趨勢（圖3a、c）。如圖3b所示，隨著鹽濃度的增加，pHc與pHφ1均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而pHmax在鹽濃度提升至100 mmol/L時消失。這一現(xiàn)象可解釋為在低鹽濃度（0～100 mmol/L）條件下，鹽離子可在一定程度上提高生物聚合物的溶解度，促進形成生物聚合物之間的靜電引力，誘導凝聚體形成。在高鹽濃度下，NaCl的競爭性吸附抑制了OVA和FUC之間的靜電引力，導致臨界pH值的降低。

2 OVA/FUC復合凝聚物的Zeta電位分析

不同鹽濃度的OVA/FUC溶液（質(zhì)量比為20∶1）中Zeta電位與pH值的關(guān)系如圖4b所示。在不含NaCl的溶液中，OVA/FUC的等電點為4.07。鹽離子的添加使復合物的等電點發(fā)生了輕微的左移，并且復合物的等電點隨著溶液中NaCl的濃度升高而降低，這是由于NaCl的靜電屏蔽作用。在較高的離子強度下（c（NaCl）≥100 mmol/L），過量的離子屏蔽了聚合物的帶電活性位點，OVA和FUC之間的靜電引力減少，這導致過多的硫酸基團無法與陽離子氨基基團結(jié)合。因此高NaCl濃度（c（NaCl）≥100 mmol/L）的復合溶液濁度在pH值小于OVA等電點時較高，且在低pH值時出現(xiàn)平臺期。此外，在整個pH值范圍內(nèi)，OVA/FUC復合物Zeta電位絕對值與溶液中鹽濃度的變化趨勢相反。Zeta電位絕對的大小與系統(tǒng)的穩(wěn)定性有關(guān)，因此高鹽濃度會導致體系的穩(wěn)定性降低。綜上，靜電相互作用為OVA/FUC凝聚體形成的主導力，且當復合物的濁度達到峰值（pHmax）時，OVA與FUC帶有相反電荷。

3 OVA/FUC復合體內(nèi)蛋白質(zhì)構(gòu)象解析

3.1 內(nèi)源熒光光譜分析

為進一步分析OVA與FUC復合凝聚過程中二者之間相互作用的分子機制，測定在pH 6.0與pH 4.5條件下不同比例OVA/FUC復合物的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如圖6所示。蛋白質(zhì)中α-螺旋的特征峰位于約208 nm和222 nm波長處，β-折疊和β-轉(zhuǎn)角的特征峰位于約216 nm和206 nm波長處。如圖6a、b所示，單一OVA的光譜峰值位于約222 nm，F(xiàn)UC的加入使所有樣品的光譜峰發(fā)生了不同程度的藍移，表明OVA/FUC復合物中蛋白質(zhì)分子的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。在pH 6.0的復合溶液中，少量FUC的加入降低了OVA光譜峰的強度（質(zhì)量比≥10∶1）。相反，過量的FUC會導致OVA光譜的峰值增大（質(zhì)量比＜10∶1）。而當復合溶液的pH值為4.5時，任何添加量的FUC均會使OVA光譜峰的強度降低，此時OVA的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。由此可見，F(xiàn)UC的復合凝聚改變了OVA的二級結(jié)構(gòu)構(gòu)象（α-螺旋與β-折疊）。

為了進一步量化FUC復合對OVA二級結(jié)構(gòu)的影響，使用BESTSEL軟件分析了蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的含量，結(jié)果如圖6c、d所示。當pH 6.0時，F(xiàn)UC的添加對OVA的二級結(jié)構(gòu)的影響不顯著。當pH 4.5時，F(xiàn)UC的存在使OVA的α-螺旋含量下降而β-折疊含量上升，這表明添加FUC后OVA分子發(fā)生了一定程度的解螺旋。此外，F(xiàn)UC對OVA的解螺旋效應在50∶1時達到最大值，而在1∶1時達到最小值，該變化歸因于溶液中過量的陰離子對OVA二級結(jié)構(gòu)變化的抑制作用。Zhang Ting等在蛋清蛋白與硫酸葡聚糖的相互作用研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。Tang Honggang等同樣發(fā)現(xiàn)帶有硫酸基團卡拉膠的復合作用促進了蛋清蛋白分子α-螺旋向β-折疊的轉(zhuǎn)變。然而大量研究表明，除硫酸化多糖外的其他陰離子多糖（如羧甲基纖維素）與蛋白質(zhì)的靜電復合對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)無顯著影響，這一現(xiàn)象可能與多糖中的硫酸基團有關(guān)。

4 OVA/FUC復合凝聚體流變學特性分析

為更深入地了解OVA/FUC凝聚體的宏觀特性，利用頻率掃描進一步探究了在pH 4.5條件下NaCl濃度和OVA/FUC質(zhì)量比對凝聚體黏彈性的影響。儲能模量（G’）反映復合體系的黏彈性，是溶液中大分子相互交聯(lián)形成大尺寸聚集體的結(jié)果。如圖7a所示，復合溶液的G’隨著FUC的添加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1時達到最大值，表明在該條件下復合溶液中蛋白質(zhì)分子間的交聯(lián)程度達到最大，聚集體的尺寸達到最大。相反，當質(zhì)量比為5∶1或1∶1時，OVA/FUC復合物的G’遠低于OVA，這一結(jié)果與相行為結(jié)果基本相符，此條件下的OVA/FUC復合物處于可溶性復合凝聚階段和共溶階段，體系中大量的聚陰離子阻礙了蛋白質(zhì)分子的進一步聚集。Niu Fuge等研究表明，由于空間位阻效應，高度支化的多糖在混合體系中比線性大分子難以形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)。因此，過多的FUC削弱了復合體的復合凝聚過程中的聚集行為。不同鹽濃度下的流變結(jié)果表明，隨著鹽濃度的增加，樣品的G’呈現(xiàn)先減小后增加的趨勢（圖7b）。這可能是由于在pH 4.5溶液體系中少量鹽的加入會抑制OVA與FUC之間的相互作用，削弱復合物的相互交聯(lián)。在50 mmol/L的NaCl濃度下，體系的G’最低。然而，當NaCl濃度達到400 mmol/L時，OVA/FUC凝聚體的G’達到最大值。這可能是由于高鹽促進了OVA分子的變性，從而促進了OVA分子間的聚集。這些結(jié)果與濁度和Zeta電位隨離子強度的變化基本一致。綜上所述，體系中過量蛋白質(zhì)或多糖的存在影響凝聚體的G’，這歸因于體系的排斥力和空間位阻效應。當?shù)鞍踪|(zhì)/多糖結(jié)合接近飽和時，復合體系作為一個電中性的整體，分子間排斥力最小，導致OVA/FUC質(zhì)量比為20∶1的復合物表現(xiàn)出最高的G’。

結(jié) 論

本實驗探究了pH值、離子強度和生物聚合物質(zhì)量比對OVA和FUC復凝聚相行為的影響。隨著OVA/FUC復配比的增加，可以與FUC結(jié)合的OVA分子數(shù)量增加，復合物的臨界pH值（pHc和pHφ1）向高pH值方向移動。當OVA/FUC的質(zhì)量比從1∶1增加到5∶1時，由于OVA和FUC之間強烈的靜電相互作用，沒有出現(xiàn)明顯的pHmax。形成復合物的最佳OVA/FUC質(zhì)量比是20∶1，它表現(xiàn)出最高的濁度，且具有較高的儲能模量。OVA和FUC之間的靜電相互作用具有顯著的鹽離子依賴性。當鹽的濃度小于100 mmol/L時，復合物的臨界pH值向更高的pH值方向移動，表明低鹽離子濃度可促進復合凝聚體的形成。然而當鹽濃度大于100 mmol/L時，靜電屏蔽效應會改變OVA與FUC之間的靜電復合狀態(tài)，臨界pH值顯著下降。同時，F(xiàn)UC的加入改變了OVA蛋白質(zhì)的分子構(gòu)象，促進了OVA的解螺旋和三級結(jié)構(gòu)的展開。綜上所述，通過改變OVA和FUC溶液的復合條件可以調(diào)控二者的復合凝聚特性，本研究可為設(shè)計基于OVA/FUC復合物的新型水凝膠和功能性納米載體奠定理論基礎(chǔ)。

本文《基于靜電相互作用的卵白蛋白與巖藻多糖相行為分析及流變學分析》來源于《食品科學》2024年45卷第9期51-59頁，作者：張婷，袁一心，嵇競弘，龔泠靈，吳昕玲，劉靜波，尚曉敏。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20230607-061。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實習編輯：王雨婷 ；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)。

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