核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，系胡桃科胡桃屬植物，是世界四大干果之一。目前，我國(guó)的核桃種植面積和產(chǎn)量居世界第一，而云南作為我國(guó)核桃生產(chǎn)的第一大省，產(chǎn)量、產(chǎn)值和種植面積均居全國(guó)第一。核桃具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有20%～25%的優(yōu)質(zhì)蛋白，核桃榨油后的核桃粕中含有54%左右蛋白質(zhì)，是一種優(yōu)良的食品原料，但核桃蛋白的主要成分為谷蛋白（70%），其溶解性差，嚴(yán)重限制了其在食品中的應(yīng)用。
云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院田洋、湯木果、陶亮*等通過(guò)以核桃粕為主要原料，利用木瓜蛋白酶對(duì)核桃蛋白進(jìn)行有限程度的水解，進(jìn)而通過(guò)超濾系統(tǒng)對(duì)水解產(chǎn)物按分子質(zhì)量分級(jí)，得到不同分子質(zhì)量的肽段與不同糖源進(jìn)行糖基化改性，篩選制備一種具有良好溶解性、乳化性及抗氧化性的改性核桃肽，旨在為核桃肽產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及其品質(zhì)改良提供一定的理論參考。
1.1 糖源對(duì)核桃肽糖基化產(chǎn)物乳化性質(zhì)的影響 在反應(yīng)溫度80 ℃、多肽質(zhì)量濃度5 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間8 h，肽糖比例1∶1條件下進(jìn)行糖基化反應(yīng)。圖1顯示，與未糖基化之前相比，酶解液及不同分子質(zhì)量核桃肽（蛋白水解物）與糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后，能夠顯著提高乳化性質(zhì)。另外，大分子質(zhì)量核桃肽的糖基化產(chǎn)物的乳化性增強(qiáng)，其中葡萄糖和麥芽糊精的糖基化產(chǎn)物乳化性明顯改善，小分子質(zhì)量核桃肽乳化性質(zhì)改善不理想，甚至出現(xiàn)降低趨勢(shì)。對(duì)于乳化穩(wěn)定性，麥芽糊精、葡聚糖的糖基化產(chǎn)物出現(xiàn)明顯改善趨勢(shì)。綜合分析，確定麥芽糊精與＞30 kDa核桃肽糖基化產(chǎn)物的乳化性及穩(wěn)定性均增強(qiáng)，可能是麥芽糊精糖鏈排列有序，空間位阻小，增加了糖鏈接入蛋白肽鏈的幾率，同時(shí)麥芽糊精的親水性和有序糖鏈結(jié)構(gòu)提高了改性產(chǎn)物的乳化穩(wěn)定性。1.2 糖源對(duì)核桃肽糖基化產(chǎn)物抗脂質(zhì)氧化能力的影響
在反應(yīng)溫度80 ℃、反應(yīng)時(shí)間8 h、多肽質(zhì)量濃度5 mg/mL和肽糖比例1∶1條件下，不同分子質(zhì)量核桃肽（蛋白水解物）、酶解液與不同糖源進(jìn)行糖基化反應(yīng)。如圖2所示，與未糖基化之前相比，糖基化改性所得產(chǎn)物，具有一定抗脂質(zhì)氧化能力，且大分子質(zhì)量核桃肽糖基化產(chǎn)物的抗脂質(zhì)氧化能力均高于酶解液和小分子質(zhì)量核桃肽的糖基化產(chǎn)物，說(shuō)明大分子質(zhì)量核桃肽更具活性，而小分子質(zhì)量的核桃肽難以形成穩(wěn)定的抗脂質(zhì)氧化物質(zhì)。另外，大分子質(zhì)量核桃肽經(jīng)不同糖源糖基化改性后，抗脂質(zhì)氧化能力最強(qiáng)的為葡萄糖和麥芽糊精，但兩種糖源之間的抗脂質(zhì)氧化能力無(wú)顯著差異。綜上所述，在酶解液及不同分子質(zhì)量核桃肽和不同糖源中，大分子質(zhì)量核桃肽（＞30 kDa）與麥芽糊精糖基化改性后，具有一定的改善作用，且有良好的乳化性質(zhì)和抗脂質(zhì)氧化能力，后續(xù)研究選用＞30 kDa核桃肽與麥芽糊精進(jìn)行糖基化改性。1.2 糖源對(duì)核桃肽糖基化產(chǎn)物抗脂質(zhì)氧化能力的影響
2 核桃肽-麥芽糊精糖基化反應(yīng)條件的確定
糖基化反應(yīng)受多種因素影響，如蛋白（多肽）與糖的配比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間等均會(huì)影響產(chǎn)物的功能特性，且糖基化反應(yīng)可通過(guò)接枝度和褐變強(qiáng)度評(píng)價(jià)其反應(yīng)程度。 在＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精比例1∶2、反應(yīng)溫度80 ℃、肽質(zhì)量濃度15 mg/mL條件下，如圖3A所示，隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，接枝度不斷升高，在反應(yīng)時(shí)間8 h，接枝度達(dá)到68.50%，8 h后接枝度變化不明顯，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，接枝度上升幅度不大；同時(shí)，褐變程度隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，反應(yīng)體系顏色變深。即反應(yīng)前期暴露在蛋白質(zhì)或肽表面的游離氨基與糖較快發(fā)生反應(yīng)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白質(zhì)或肽發(fā)生變化，使內(nèi)部的氨基進(jìn)一步參與反應(yīng)，導(dǎo)致高級(jí)階段產(chǎn)生的類黑精等含氮聚合物不溶于水，使感官質(zhì)量及功能特性降低。因此確定8 h是最佳反應(yīng)時(shí)間。 
如圖4A所示，隨著反應(yīng)體系中核桃肽質(zhì)量濃度的增加，接枝度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在肽質(zhì)量濃度為15 mg/mL時(shí)達(dá)到最高，接枝度為84.45%，后期接枝度不斷下降。關(guān)于褐變度，前期呈現(xiàn)持續(xù)增加趨勢(shì)，在肽質(zhì)量濃度為15 mg/mL褐變度已上升到較高趨勢(shì)，但褐變度整體可接受，綜合考慮，選擇肽質(zhì)量濃度15 mg/mL為最佳濃度。溫度能夠影響美拉德反應(yīng)速率及進(jìn)程，進(jìn)而影響其反應(yīng)產(chǎn)物。在其他條件不變的情況下，如圖3B所示，反應(yīng)前期接枝度隨反應(yīng)溫度的升高呈緩慢上升趨勢(shì)。但過(guò)高溫度會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生不同程度的聚集，反應(yīng)體系中不溶性組分顯著增多，接枝度不再增加；產(chǎn)物的褐變度隨著溫度升高呈不斷增加的趨勢(shì)，溫度較低時(shí)，褐變緩慢發(fā)生，而反應(yīng)溫度過(guò)高易誘導(dǎo)美拉德反應(yīng)的中間階段和最后階段發(fā)生，增加了糖基化產(chǎn)物的復(fù)雜性，產(chǎn)物安全性降低，嚴(yán)重影響產(chǎn)物的感官品質(zhì)。因此，確定80 ℃為最佳反應(yīng)溫度。 由圖4B可知，當(dāng)＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精比例為1∶2時(shí)，其接枝度和褐變度均較高，這可能是由于在糖含量一定的情況下，增大＞30 kDa核桃肽添加量，有助于增加溶液中參與美拉德反應(yīng)的游離氨基端與麥芽糊精還原末端的接觸幾率。然而當(dāng)＞30 kDa核桃肽添加量進(jìn)一步增大時(shí)，游離氨基氮含量不再增加，即參與反應(yīng)的＞30 kDa核桃肽達(dá)到飽和。因此，選擇核桃肽-麥芽糊精比例1∶2為最佳條件。3 核桃肽-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)表征
圖5A顯示，＞30 kDa核桃肽主要有3 個(gè)主要條帶，分子質(zhì)量主要集中在55、40、10～15 kDa 3 個(gè)區(qū)域。對(duì)照組僅經(jīng)加熱處理，核桃肽在10～15、40、55 kDa附近的特征條帶顏色變淺，可能是高溫處理使蛋白發(fā)生適當(dāng)解鏈，蛋白條帶向低分子質(zhì)量區(qū)域遷移。糖基化產(chǎn)物組（核桃水解蛋白肽糖基化產(chǎn)物）條帶中10～15 kDa及55 kDa條帶顏色變深，且在分離膠上端出現(xiàn)新的條帶，即麥芽糊精與＞30 kDa核桃肽糖基化反應(yīng)導(dǎo)致核桃肽分子質(zhì)量增大，形成新的產(chǎn)物。在圖5B糖染色圖中，核桃肽（＞30 kDa）與對(duì)照組經(jīng)糖染后均為出現(xiàn)顏色反應(yīng)，糖基化產(chǎn)物組條帶上端區(qū)域出現(xiàn)染色區(qū)域，即形成了糖蛋白聚合物，說(shuō)明＞30 kDa核桃蛋白水解物的糖基化改性產(chǎn)物中具有含有糖鏈的大分子蛋白肽產(chǎn)物。 為考察＞30 kDa核桃肽與糖分子之間是否形成共價(jià)鍵，對(duì)其糖基化修飾前后產(chǎn)物進(jìn)行FTIR分析。如圖6所示，糖基化處理＞30 kDa核桃肽在1 024 cm-1和1 403 cm-1處有較強(qiáng)的吸收峰，這兩處吸收分別是C—O鍵和C—N鍵的伸縮振動(dòng)（表1），結(jié)果表明＞30 kDa核桃肽與麥芽糊精之間形成了共價(jià)鍵。1 658 cm-1和1 546 cm-1分別是C＝O鍵的伸縮振動(dòng)和—N—H鍵的平面彎曲振動(dòng)，糖基化產(chǎn)物在酰胺II帶的吸收光譜有所增強(qiáng)，說(shuō)明共價(jià)鍵已形成。此外，2 929 cm-1和3 378 cm-1處的吸收分別表示—C—H（sp3）鍵的反對(duì)稱伸縮振動(dòng)和—O—H鍵的伸縮振動(dòng)。因此FTIR圖表示＞30 kDa核桃肽經(jīng)糖基化改性，分子間相互作用力和化學(xué)鍵都發(fā)生了變化，進(jìn)而空間結(jié)構(gòu)隨之改變。 
如圖7所示，＞30 kDa核桃肽糖基化修飾后其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。在195～220 nm范圍內(nèi)兩者均出現(xiàn)負(fù)峰值，與＞30 kDa核桃肽相比，糖基化產(chǎn)物的遠(yuǎn)紫外光譜峰發(fā)生了變化，表明糖基化反應(yīng)確實(shí)改變了蛋白肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)。采用CNDD軟件對(duì)α-螺旋、反平行、平行、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的百分比例進(jìn)行估算，其中，與α-螺旋相比，β-折疊具有不確定性，可以平行或反平行方式形成，α-螺旋和β-折疊是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中的有序結(jié)構(gòu)，具有高度穩(wěn)定性。如表2所示，與＞30 kDa核桃肽相比，糖基化修飾后其α-螺旋與反平行、平行含量明顯增加，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲含量下降。肽空間結(jié)構(gòu)變得更加松散，分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，柔韌性、兩親性增加，即＞30 kDa核桃肽經(jīng)糖基化改性后，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)了變化，增強(qiáng)了＞30 kDa核桃肽結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。
4 核桃肽-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物的功能特性
如圖8所示，＞30 kDa核桃肽與＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物在pH 4.5～5.0范圍內(nèi)溶解度最低，這是由于蛋白肽在等電點(diǎn)附近會(huì)出現(xiàn)絮凝沉淀現(xiàn)象；在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)糖基化產(chǎn)物的溶解性高于核桃肽，且在中性條件（pH 7.0）下兩者差異最大，即在中性食品中糖基化肽具有更好的溶解性優(yōu)勢(shì)，從而使其水溶性增加。由于糖類帶有大量親水羥基，經(jīng)糖基化反應(yīng)后生成糖基化產(chǎn)物的親水基團(tuán)數(shù)目增多，從而提高了核桃肽＞30 kDa的溶解性。 如表3可知，＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性為（83.24±1.64）m2/g、（218.49±3.55）min，分別較＞30 kDa核桃肽提高了68.60%和90.27%，這是因?yàn)椋?0 kDa核桃肽糖基化改性使其空間結(jié)構(gòu)變得松散，蛋白肽分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)適當(dāng)暴露，導(dǎo)致界面張力降低，從而提高其乳化性及穩(wěn)定性。同時(shí)，糖基化改性也可改善其吸水性及吸油性，但無(wú)顯著差異。＞30 kDa核桃肽糖基化改性后其表面疏水性降低了35.20%，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解會(huì)導(dǎo)致疏水基團(tuán)暴露在表面，但與糖接枝反應(yīng)會(huì)引入親水分子，使蛋白肽空間分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，α-螺旋結(jié)構(gòu)上升，導(dǎo)致分子內(nèi)部疏水性結(jié)合位點(diǎn)暴露程度減小，疏水性降低。
如表4所示，＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物的Fe2+螯合能力無(wú)改善，原因可能是糖的比例過(guò)高，糖基化反應(yīng)減慢，從而使Fe2+螯合能力趨于平緩、甚至降低。而DPPH自由基清除力較＞30 kDa核桃肽提高了49.71%。也有研究表明，多肽分子與糖美拉德反應(yīng)能有效增強(qiáng)其DPPH自由基清除能力，并且隨著美拉德反應(yīng)進(jìn)程的延續(xù)，終產(chǎn)物類黑精及雜環(huán)化合物的增多，自由基清除能力會(huì)相應(yīng)增強(qiáng)。另外抗脂質(zhì)氧化能力較＞30 kDa核桃肽分別提高了43.68%，說(shuō)明糖基化產(chǎn)物能夠在一定程度上抑制Fe2+引發(fā)的卵磷脂分散體系過(guò)氧化，同時(shí)也說(shuō)明多肽糖基化產(chǎn)物具有防止乳液體系中脂質(zhì)氧化的潛力。
4.4 糖基化核產(chǎn)物乳液微觀結(jié)構(gòu) 將＞30 kDa核桃肽及其＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精糖基化產(chǎn)物制備的核桃油乳狀液在4 ℃條件下貯存24 h，采用激光共聚焦掃描顯微鏡對(duì)其乳狀液的微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，如圖9所示，尼羅紅（Nile Red）用于油的染色，呈紅色熒光，尼羅藍(lán)（Nile Blue）用于蛋白肽的染色，呈現(xiàn)綠色熒光。在＞30 kDa核桃肽-麥芽糊精制備的核桃油乳狀液中，核桃蛋白肽分散在油-水界面上，液滴直徑較大，油滴能被蛋白肽很好地包裹起來(lái)，而＞30 kDa核桃肽制備的乳狀液，只有少量的油脂被蛋白肽包裹。結(jié)果證實(shí)了核桃肽經(jīng)麥芽糊精糖基化改性后，能更好分散在油水界面，在油滴表面形成很厚的吸附層，起到穩(wěn)定乳狀液的作用，能有效抑制乳液液滴間的聚集和絮凝，增強(qiáng)乳狀液的穩(wěn)定性，在乳液類食品開(kāi)發(fā)中具有較好的應(yīng)用前景。
本研究篩選到酶解核桃蛋白水解物中分子質(zhì)量＞30 kDa核桃肽與麥芽糊精進(jìn)行糖基化改性能提高其乳化能力和抗脂質(zhì)氧化能力，其中，糖基化產(chǎn)物的最佳反應(yīng)條件為核桃肽-麥芽糊精比例1∶2、反應(yīng)時(shí)間8 h、反應(yīng)溫度80 ℃、肽質(zhì)量濃度15 mg/mL。從SDS-PAGE角度證實(shí)分子質(zhì)量＞30 kDa核桃肽經(jīng)糖基化改性導(dǎo)致糖蛋白聚合物生成，F(xiàn)TIR及圓二色譜證明核桃肽與麥芽糊精形成了糖基化共價(jià)復(fù)合物。在功能特性方面，經(jīng)糖基化改性后的核桃水解蛋白肽的溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性提高，表面疏水性降低，DPPH自由基清除力和抗脂質(zhì)氧化能力顯著提高，同時(shí)糖基化改性后的核桃蛋白肽對(duì)核桃油的包裹能力顯著高于未糖基化之前的核桃蛋白肽，即糖基化核桃蛋白肽在乳液類產(chǎn)品開(kāi)發(fā)及其油脂抗氧化方面具有一定的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。
本文《不同分子質(zhì)量糖基化核桃肽的制備及功能特性分析》來(lái)源于《食品科學(xué)》2023年44卷10期205-214頁(yè)。作者：田洋，湯木果，周艷，門德盈，趙存朝，陶亮. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220525-311.
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