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云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院杜剛教授等：開菲爾粒中白地霉的分離鑒定及揮發(fā)性成分分析

開菲爾，又稱雪蓮菌，是一種產(chǎn)自產(chǎn)高加索山脈和我國(guó)西藏地區(qū)的混菌發(fā)酵酸奶。開菲爾對(duì)多種炎癥、血清膽固醇、高血壓有改善的功效。近年來(lái)，利用宏基因組技術(shù)研究開菲爾體系的菌群結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)開菲爾體系中包含乳桿菌屬、雙歧桿菌屬、釀酒酵母屬、假絲酵母屬、畢赤酵母屬、白地霉（Geotrichum candidum）等真菌和細(xì)菌。同時(shí)對(duì)分離自開菲爾體系的菌株已進(jìn)行了基因組研究。

云南民族大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院李智昊、莫海英、杜剛*等對(duì)分離自開菲爾體粒的G. candidum菌株進(jìn)行基因組重測(cè)序，從基因組層面進(jìn)行分類鑒定研究；對(duì)實(shí)驗(yàn)菌進(jìn)行功能注釋，了解開菲爾源G. candidum的基因組結(jié)構(gòu)和功能，挖掘其揮發(fā)性香味物質(zhì)的代謝途徑；利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用法對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定。本研究可為開菲爾源G. candidum在食品中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

結(jié)果與分析

1. K2菌株電鏡下形態(tài)觀察

如圖1所示，K2菌株形態(tài)為圓柱形，外壁有外殼包裹，菌株單個(gè)大小約為（5.8±1.0）μm×（2.3±0.4）μm，菌體表面粗糙且有不規(guī)則褶皺，無(wú)破損現(xiàn)象，相鄰菌株間無(wú)黏連現(xiàn)象。Z7-1、Z8-4兩株菌菌株形態(tài)為圓柱形，外壁有外殼包裹，單個(gè)大小在（12.5±3.5）μm×（3.0±0.5）μm，菌體略大于K2，菌體表面有不規(guī)則褶皺。3 株菌均與已報(bào)導(dǎo)G. candidum結(jié)構(gòu)相似。

2. 理化性質(zhì)鑒定結(jié)果

如表1所示，實(shí)驗(yàn)菌株K2在葡萄糖和蔗糖試管內(nèi)為陽(yáng)性、Z7-1、Z8-4在葡萄糖、麥芽糖和蔗糖管中為陽(yáng)性，結(jié)果表明K2、Z7-1、Z8-4菌株均可以利用并分解葡萄糖和蔗糖產(chǎn)生相應(yīng)的酸，同時(shí)Z8-4、Z7-1還可以利用及分解麥芽糖。IMViC實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)菌株K2、Z7-1、Z8-4在伏普實(shí)驗(yàn)及中為陰性；在吲哚實(shí)驗(yàn)及甲基紅實(shí)驗(yàn)中呈陽(yáng)性。表明3 株菌可以利用色氨酸，且可代謝葡萄糖產(chǎn)酸。

3 菌株分子的鑒定

從基因組中找到26S rDNA，利用軟件MEGA7.0構(gòu)建進(jìn)化樹。3 株菌的26S rDNA在NCBI用BLAST查找近緣物種，基于序列相似度，選取G. candidum KR632575.1、里氏半乳酵母（Galactomyces reessii NG055388）、森林地霉（Geotrichum silvicola KC510046）、白花雙足囊菌（Dipodascus albidus NG066154）、膝狀雙足囊菌（Dipodascus geniculatus NG066466）、克氏地霉（Geotrichum klebahnii MH130231）、彩囊鈣絲菌（Badhamia utricularis HQ604855）、冠突曲霉（Aspergillus cristatus MG199954.1）構(gòu)建進(jìn)化樹。如圖2所示，進(jìn)化樹中3 株實(shí)驗(yàn)菌株均與G. candidum聚在一簇，鑒定3 株實(shí)驗(yàn)菌株K2、Z7-1、Z8-4均為真核生物界（Eukaryota）雙核亞界（Dikarya）子囊菌門（Ascomycota）酵母亞門（Saccharomycotina）酵母綱（Saccharomycetes）酵母目（Saccharomycetales）雙足囊菌科（Dipodascaceae）地霉屬（Geotrichum）G. candidum。

4 基因組測(cè)序數(shù)據(jù)的處理結(jié)果

DNA片段采用軟件plantnus進(jìn)行組裝得到基因組信息，如表2所示，K2、Z7-1、Z8-4長(zhǎng)度分別為24 984 695、25 295 181、24 887 411 bp，GC含量分別為41.43%、41.37%、41.39%。結(jié)合組裝結(jié)果及統(tǒng)計(jì)信息（表3），3 株菌與已報(bào)道多株G. candidum的基因組大小、GC含量相近。

5 基因序列比對(duì)、DDH和ANI結(jié)果

K2、Z7-1、Z8-4的基因組序列與G. candidum LMA-244、G. reessii LMA-1148、D. albidus NRRL Y-12859、D. geniculatus NRRL Y-17628四種參考菌株的基因組序列進(jìn)行BLAST、DDH和ANI比對(duì)鑒定，如表4所示，K2、Z7-1、Z8-4與已知G. candidum LMA-244的本地BLAST（2.6.0）結(jié)果分別為99.00%、99.00%、99.00%，DDH結(jié)果為99.50%、99.40%、99.50%，其結(jié)果均大于70%，可以支持歸為同一物種，ANI的結(jié)果為98.66%、98.65%、98.68%，均大于95%～96%，同樣支持歸為同一物種。依據(jù)BLAST、DDH和ANI的比對(duì)分析結(jié)果與26S rDNA在NCBI上BLAST比對(duì)結(jié)果一致。進(jìn)一步確證菌株K2、Z7-1、Z8-4為G. candidum LMA-244。

6 GO分析結(jié)果

選取G. candidum K2進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼基因預(yù)測(cè)，在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中注釋到46 127 個(gè)基因。如圖3所示，細(xì)胞組成約占總功能注釋的40.74%，其中的細(xì)胞部分和途徑基因富集程度最高，均有4 172 個(gè)基因；生物過(guò)程約占總功能注釋的47.54%，其中的細(xì)胞過(guò)程途徑基因富集程度最高，有3 869 個(gè)基因，表明G. candidum K2含有大量與生物學(xué)過(guò)程相關(guān)的基因，包括參與自身的核苷酸代謝、嘌呤代謝、細(xì)胞分裂等過(guò)程；分子功能約占總功能注釋基因的11.73%，其中的催化活性（途徑基因富集程度最高，有2 075 個(gè)基因。

7 KEGG分析結(jié)果

圖4顯示，G. candidum K2基因組中與其對(duì)應(yīng)的基因共7 311 個(gè)，按功能可分為細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝、生物系統(tǒng)6 大類。其中富集最高的為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有369 個(gè)基因；富集程度較高的分類有翻譯、運(yùn)輸和分解代謝、碳水化合物代謝分別注釋到367、338 個(gè)和326 個(gè)基因。這些途徑對(duì)于維持菌體正常生命活動(dòng)必不可少，故有大量基因富集。

8 COG分析結(jié)果

在COG分析（圖5）中，共注釋到G. candidum K2基因組的蛋白質(zhì)編碼基因共4 568 個(gè)，將其按功能分為23 個(gè)不同類型。主要包括：翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和伴侶蛋白424 個(gè)，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和小泡運(yùn)輸421 個(gè)，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成386 個(gè)，轉(zhuǎn)錄380 個(gè)及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制374 個(gè)。

9 萜類合成途徑挖掘

萜類合成途徑與揮發(fā)性香味物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)，KEGG富集分析挖掘到萜類骨架合成、倍半萜類及三萜類生物合成相關(guān)基因見表5。如圖6所示，在萜類骨架的合成途徑中共有31 個(gè)蛋白編碼了戊二醛二磷酸合酶，該酶將起始物焦磷酸香葉基香葉酯生成戊二酸焦磷酸，再經(jīng)過(guò)由2 個(gè)蛋白編碼的貝殼杉烯氧化酶生成貝殼杉烯酸酯。貝殼杉烯酸酯作為一種二萜化合物經(jīng)常用于合成其他萜類化合物。如圖7所示，三萜化合物的合成途徑中由3 個(gè)蛋白編碼的角鯊烯單加氧酶將底物鯊烯催化合成三萜化合物2,3-環(huán)氧鯊烯。2,3-環(huán)氧鯊烯可以經(jīng)過(guò)次生代謝途徑參與合成其他固醇類化合物。萜類合成途徑分析表明G. candidum K2具備合成揮發(fā)性香味物質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。

10 GC-MS分析結(jié)果

圖8為G. candidum K2在YPD液體中揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖，其分析結(jié)果見表6。共鑒定得到50 種揮發(fā)性物質(zhì)，其中包括烴類、醇類、酯類、酮類、萜類物質(zhì)。其中烴類共9 種占比18.0%，醇類共3 種占比6.0%，酯類共6 種占比12.0%，酮類共5 種占比10.0%，萜類共27 種占比54.0%。

本研究中分析到多種萜類揮發(fā)性成分，3-蒈烯、α-蒎烯、對(duì)傘花烴呈花香，L-α-松油醇、4-萜烯醇、萜品醇呈松木和丁香的香氣，且閾值較低。酯類化合物多數(shù)都有香味，主要表現(xiàn)為花香味，其中乙酸α-松油酯呈木香花香味。

結(jié)論與討論

從昆明地區(qū)的開菲爾粒中分離得到3 株實(shí)驗(yàn)菌株K2、Z7-1、Z8-4，結(jié)合形態(tài)觀察、26S rDNA序列同源性分析初步鑒定為G. candidum。對(duì)3 株開菲爾源的G. candidum基因組測(cè)序，分析K2、Z7-1、Z8-4與奶酪來(lái)源G. candidum LMA-244的基因組相似度，DDH分析相似度分別為99.50%、99.40%、99.50%， ANI分析相似度分別為98.66%、98.65%、98.68%。最終鑒定K2、Z7-1、Z8-4均為G. candidum LMA-244。

采用菌株的26S rDNA而非ITS序列鑒定，是基于研究發(fā)現(xiàn)26S rDNA相對(duì)ITS序列包含更豐富的信息，同時(shí)26S rDNA的D1/D2區(qū)序列已建成了完備的分析數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)酵母屬菌種的鑒定更為準(zhǔn)確。鑒定結(jié)果K2、Z7-1、Z8-4與已知的異源G. candidum LMA-244歸為同一物種。

萜類合成途徑與揮發(fā)性香味物質(zhì)的產(chǎn)生密切相關(guān)， KEGG富集分析挖掘到萜類骨架合成、倍半萜類及三萜類生物合成相關(guān)基因，表明G. candidum K2具備合成揮發(fā)性香味物質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)。G. candidum K2在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生復(fù)合花果香氣， GC-MS分析發(fā)現(xiàn)50 種揮發(fā)性化合物，3-蒈烯、α-蒎烯和對(duì)傘花烴呈花香，L-α-松油醇呈松木香，4-萜烯醇、萜品醇呈丁香味，乙酸α-松油酯呈木香花香。推測(cè)G. candidum是開菲爾體系香味物質(zhì)的重要貢獻(xiàn)菌株。

本研究通過(guò)基因組測(cè)序和生物信息學(xué)分析，研究開菲爾源的G. candidum的基因組結(jié)構(gòu)和功能。GO注釋結(jié)果顯示，催化活性和結(jié)合等分子功能方面是G. candidum K2的蛋白功能主要集中區(qū)，該類蛋白廣泛參與細(xì)胞代謝過(guò)程以及自身生化反應(yīng)所需的催化過(guò)程，為蛋白質(zhì)的合成加工及其功能發(fā)揮提供了分子基礎(chǔ)。KEGG結(jié)果表明，G. candidum K2的代謝途徑豐富，能夠滿足生物體自身與外界環(huán)境進(jìn)行能量和物質(zhì)交換，同時(shí)能對(duì)外界環(huán)境變化作出及時(shí)的反應(yīng)，增強(qiáng)了供試菌對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性。COG預(yù)測(cè)顯示有豐富的基因參與生命體的次生代謝產(chǎn)物的合成、運(yùn)輸及代謝，表明其次生代謝途徑眾多，值得后期進(jìn)行進(jìn)一步挖掘有價(jià)值的次生代謝產(chǎn)物。本研究對(duì)G. candidum K2進(jìn)行了基因組測(cè)序與分析，便于全面地認(rèn)識(shí)該菌株，為開菲爾源的G. candidum的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

本文《開菲爾粒中白地霉的分離鑒定及揮發(fā)性成分分析》來(lái)源于《食品科學(xué)》2023年44卷10期123-131頁(yè).作者：李智昊，莫海英，陳鑫，銀蒙芳，杜剛. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220514-181.