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淮陰工學(xué)院時號副教授等：高溫木聚糖酶Pthxyn酶學(xué)性質(zhì)及其在啤酒釀造中的應(yīng)用

木聚糖是半纖維素的主要成分且分布廣泛，其主鏈主要由木糖聚合而成、側(cè)鏈含有多種取代基且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的異質(zhì)多糖。降解木聚糖的水解酶中最為重要的糖苷水解酶（GH）是β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶。木聚糖酶主要分布于GH10和GH11家族，其在食品、飼料、造紙、紡織與生物能源領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。

大麥芽發(fā)酵啤酒歷史悠久。大麥芽胚乳細胞壁含有26% β-葡聚糖與約71%的阿拉伯木聚糖。在麥芽糖化階段添加木聚糖酶，可以降低阿拉伯木聚糖黏度和提高麥汁過濾率。盡管目前已有很多關(guān)于木聚糖的報道，但在麥芽汁糖化過程中應(yīng)用效果較好的木聚糖酶仍然很少，因此需要通過基因工程的方法，提高木聚糖酶在麥芽糖化過程中的催化活性。

淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院李青飛、劉越、時號*等將來源于極端嗜熱細菌Pseudothermotogathermarum的高溫木聚糖酶基因在大腸桿菌中進行克隆、表達、純化及重組蛋白的酶學(xué)性質(zhì)研究，將其應(yīng)用到啤酒糖化過程中并分析水解產(chǎn)物中木糖和葡萄糖含量變化。研究可為重組木聚糖酶在啤酒釀造工業(yè)中的潛在應(yīng)用提供一定理論支持。

1 重組木聚糖酶的誘導(dǎo)表達和純化

將IPTG誘導(dǎo)后的重組菌株發(fā)酵液離心、洗滌、重懸，超聲波破碎，高速離心獲得粗酶液，按上述DNS法測定重組酶活力，結(jié)果測得木聚糖酶粗酶液比活力為25.74 U/mg，親和層析純化后，該重組酶的比活力達到151.9 U/mg。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，約在130 kDa存在的蛋白條帶分子質(zhì)量與該酶理論分子質(zhì)量一致（圖2）。此結(jié)果表明重組木聚糖酶蛋白已成功表達和純化。

2 重組木聚糖酶學(xué)性質(zhì)

2.1 木聚糖酶Pthxyn最適反應(yīng)溫度及穩(wěn)定性

在pH 5.5條件下，檢測重組木聚糖酶在60～100 ℃范圍內(nèi)活力（圖3a）可知，處于90～100 ℃范圍內(nèi)的重組木聚糖有較高的催化活性，該酶最適反應(yīng)溫度為95 ℃；由圖3b可以看出，該重組酶具有較好的熱穩(wěn)定性，75 ℃處理重組木聚糖酶1 h，剩余酶活力約為83%，隨后活力不斷下降，到達2 h時，酶活力仍有57.7%，80 ℃處理1 h，剩余酶活力約為53.3%，隨后酶活力不斷下降，到達2 h時，酶活力僅有26.8%，然而在85 ℃處理1 h，剩余酶活力約為43%，到達2 h后，酶活力幾乎喪失。

2.2 木聚糖酶Pthxyn最適反應(yīng)pH值及穩(wěn)定性

在80 ℃條件下，檢測重組木聚糖酶在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)活力（圖3c），結(jié)果表明，酶最適pH值為5.5；由圖3d可以看出，重組木聚糖酶在pH 5.0～8.0的條件下保溫2 h，仍具有80%的酶活力，表明該酶具有較好的pH值穩(wěn)定性。當(dāng)該重組木聚糖酶在pH 5.0～8.0范圍之外時，該酶的穩(wěn)定性變差。

2.3 金屬離子和有機試劑對酶活力的影響

圖4結(jié)果表明，當(dāng)終濃度為1 mmol/L和10 mmol/L時，K＋、Ni2＋、Ca2＋、Co2＋、Mg2＋、Tris、Tween 80均對酶活力有激活促進作用。但是，Cu2＋、SDS均明顯抑制重組酶活力。其中，當(dāng)Ba2＋濃度為1 mmol/L時，重組酶活力被提高至1.25 倍，而Ba2＋的濃度為10 mmol/L時，幾乎喪失酶活力。1 mmol/L Mn2＋對重組酶活力起輕微抑制作用，而10 mmol/L Mn2＋能將酶活力提高至2.9 倍。因此適當(dāng)添加上述促進因子，能夠顯著提高重組酶水解效率，而EDTA對其酶活力幾乎沒有影響。

2.4 木聚糖酶底物特異性分析

表1顯示，重組木聚糖酶能夠水解木聚糖，但不能水解CMC-Na、葡聚糖等，表明該酶是通過內(nèi)切方式降解木聚糖。

2.5 酶促動力學(xué)參數(shù)

木糖質(zhì)量分數(shù)為0.2 %～0.5 %，磷酸鹽緩沖液pH 5.5，在80 ℃處理10 min。由圖5測得重組酶對木糖的Km和Vmax分別為0.36 mg/mL和243 U/mg。結(jié)果表明重組木聚糖酶具有較好的催化效率。

3 大麥、小麥酶解液分析

如圖6所示，以大麥初始樣品為例，木糖與葡萄糖出峰時間分別約為5 min和7 min，并且木糖和葡萄糖出峰面積均較小；加入重組木聚糖酶后的大麥樣品在相近的出峰時間處，木糖與葡萄糖出峰面積較初始大麥樣品中峰面積呈正相關(guān)趨勢，這是因為加入的重組木聚糖酶與內(nèi)源性的葡聚糖酶產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使得大麥中木聚糖與阿拉伯糖水解成木糖，而大麥中內(nèi)源性的葡聚糖酶，由于兩種酶的協(xié)同效應(yīng)也使得葡聚糖進一步水解為葡萄糖。再通過大麥、小麥標(biāo)準曲線與兩者峰面積可以計算出大麥、小麥中初始的葡萄糖與木糖含量，以及添加木聚糖酶后酶解液中葡萄糖和木糖生成量。

反應(yīng)體系50 mL，圖7a顯示，空白組中大麥汁中約含有葡萄糖20 g/L，木糖僅有0.017 g/L，隨著木聚糖酶的添加，與大麥中內(nèi)源性酶產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，使得葡萄糖與木糖產(chǎn)率提高。當(dāng)木聚糖酶添加量為4 mg時，葡萄糖與木糖生成量約為36.52 g/L和1.24 g/L，繼續(xù)添加木聚糖酶，結(jié)果表明葡萄糖與木糖的最大生成量分別約為36.57 g/L和1.25 g/L，當(dāng)酶添加量達到4 mg后，葡萄糖和木糖幾乎不再增多。

由圖7b所示，空白組中顯示小麥含有21.9 g/L的葡萄糖，木糖僅有0.003 g/L，添加一定量木聚糖酶后，葡萄糖和木糖的含量明顯增多。當(dāng)木聚糖酶添加量為4 mg時，葡萄糖和木糖生成量分別為36.57 g/L和0.706 g/L，當(dāng)木聚糖酶添加量超過4 mg時，葡萄糖和木糖含量幾乎維持不變，最終得到葡萄糖最大生成量為36.63 g/L，木糖為0.708 g/L。

討論

目前，已有多種耐高溫或耐酸性木聚糖酶在大腸桿菌中成功實現(xiàn)異源表達。而本研究從嗜熱厭氧菌P. thermarum中分離出來的木聚糖酶基因pthxyn表達水平明顯高于很多木聚糖酶在大腸桿菌中的表達。因此木聚糖酶基因pthxyn的高效表達在生產(chǎn)中具有重要應(yīng)用價值。

對于P. thermarum產(chǎn)生酶研究集中在作為輔助因子提高賴氨酸合成量方面。而P. thermarum產(chǎn)生木聚糖酶的研究尚鮮有報道，本研究從該菌中分離出耐酸耐高溫的木聚糖酶基因，成功在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達、純化，并得到了可溶性的木聚糖酶，該重組木聚糖酶pH值耐受范圍為5.0～8.0，保溫2 h仍能保持80%酶活力；在75 ℃保溫1 h，仍能保持80%酶活力。大多數(shù)金屬離子和EDTA對該重組木聚糖酶影響較小。該重組木聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)明顯優(yōu)于很多木聚糖酶。此外，本研究木聚糖酶基因pthxyn還能夠顯著降解麥芽糖化過程中的阿拉伯木聚糖，從而降低麥汁黏度，提高過濾速度，改善啤酒品質(zhì)。

耐酸耐高溫木聚糖酶在實際應(yīng)用中非常重要，但通過基因工程改造獲得的耐酸耐高溫木聚糖酶只能溫度或pH值耐受性符合生產(chǎn)要求，難以兩者兼顧。在啤酒釀造的麥芽汁糖化階段，pH值大致為5.0～6.6，溫度為65～71 ℃，而本研究獲得的木聚糖酶pH值耐受范圍為5.0～8.0，75 ℃保溫1 h，仍能保持83%酶活力，其性能相比較其他幾種應(yīng)用于啤酒釀造中的木聚糖酶均具有明顯優(yōu)勢。

本研究從P. thermarum分離出耐酸耐高溫的木聚糖酶基因，并通過大腸桿菌實現(xiàn)了高效表達，獲得的重組木聚糖酶比活力達到151.9 U/mg。由于該重組酶具備較好的耐熱耐高溫特性，因此首次嘗試將該重組酶直接應(yīng)用到麥芽汁糖化過程中，結(jié)果表明，大麥和小麥中木糖分別增加了1.233 g/L和0.705 g/L，麥芽汁黏度顯著降低。綜上所述，該重組木聚糖由于其良好的耐酸耐高溫特性，及其能降低麥芽汁黏度，提高過濾速度，因此在釀造工業(yè)中具有很好的應(yīng)用前景。

本文《高溫木聚糖酶Pthxyn酶學(xué)性質(zhì)及其在啤酒釀造中的應(yīng)用》來源于《食品科學(xué)》2023年44卷第10期181-187頁，作者：李青飛，劉越，言行，聶新玲，李相前，譚中標(biāo)，時號。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220503-024。