果膠是植物細胞壁的主要成分之一，以高度酯化的方式來保持植物組織的完整性和剛性。果膠甲基酯酶（PME）廣泛存在于自然界高等植物和微生物中，可以沿果膠中HG鏈隨機或線性地催化水解，最終生成低分子質(zhì)量果膠酸。另一方面，在二價陽離存在的情況下，PME脫甲酯化的HG鏈可以與其交聯(lián)形成不溶性鈣凝膠并裹挾周圍的顆粒物共沉淀，這往往導(dǎo)致番茄醬、渾濁果蔬汁等產(chǎn)品在貯藏期間出現(xiàn)結(jié)塊、相分離等品質(zhì)劣變。針對不同的產(chǎn)品往往需要采用不同的加工方式處理，甚至是不同加工方式的聯(lián)合處理才能達到有效鈍化內(nèi)源PME活性的目的。
中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉一璇、田學(xué)智和王永濤*等人以抑制PME活性為出發(fā)點，系統(tǒng)梳理當前不同食品加工方式對PME的抑制效果，并探討相應(yīng)的作用機理，以期為今后的實際工業(yè)生產(chǎn)提供指導(dǎo)。
PME廣泛存在于高等植物中，在果蔬制品的貯藏期品質(zhì)穩(wěn)定性方面具有重要影響。通過對目前已獲得的超過100 種植物和微生物PME的氨基酸序列的比對發(fā)現(xiàn)，其一級和四級結(jié)構(gòu)在植物分類單元中是非常保守的。如圖1所示，PME的果膠結(jié)合位點位于穿過分子的長且淺的裂縫中，該裂縫中心部分主要由一些芳香族殘基（Phe84、Tyr139、Phe160、Tyr222、Trp227、Phe250和Trp252）排列而成，具有碳水化合物結(jié)合位點的特征。當前對于PME同工酶體現(xiàn)出功能差異的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)解析還鮮有報道。 
PME活性的調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，受到環(huán)境溫度、pH值、陽離子、PME抑制劑等多種因素的共同影響。溫度是影響所有酶促反應(yīng)的重要因素，一般而言，PME活性的最適溫度在45～55 ℃之間，取決于其來源和基質(zhì)。同一植物中往往存在耐熱性不同的PME同工酶。不同PME的最適pH值不同，大多數(shù)植物的PME等電點在中性至堿性范圍。改變環(huán)境pH值可以顯著改變PME活性，這是由于帶電氨基酸的電離狀態(tài)被改變，與底物的結(jié)合受到影響。陽離子對于大多數(shù)植物PME活性至關(guān)重要。一般情況下，PME活性大多隨鹽濃度的增加而增加，直至最佳濃度，而高于該濃度后活性降低，最佳濃度取決于陽離子的種類。當前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種對PME活性具有抑制效果的抑制劑，主要包括一些低分子質(zhì)量蛋白、多酚和多糖等。PME的殘余活性會對果蔬制品的貯藏品質(zhì)產(chǎn)生嚴重的不良影響，如造成果汁沉淀、結(jié)塊等。因此，對PME活性的充分抑制顯得十分重要。總之，PME的殘余活性會對果蔬制品的貯藏品質(zhì)產(chǎn)生嚴重的不良影響，如造成果汁沉淀、結(jié)塊等。因此，對PME活性的充分抑制顯得十分重要。同大多數(shù)酶促反應(yīng)類似，當前抑制PME活性的思路主要有以下兩種：一是通過改變酶自身的分子結(jié)構(gòu)，例如熱處理、調(diào)節(jié)體系pH值等使酶構(gòu)象發(fā)生變化，降低催化能力；二是改變酶-底物相互作用，通過加入抑制劑，使酶與抑制劑結(jié)合發(fā)生可逆或不可逆的變化，進而影響其與底物的結(jié)合。傳統(tǒng)熱加工
傳統(tǒng)熱加工方法是食品加工中通常使用的鈍酶手段，一般是指基于目標酶的耐熱性，將樣品加熱至所需溫度并保持一定時間。溫度一定程度的升高會激活PME活性，促進PME對果膠的去甲氧基化，但當溫度繼續(xù)上升，達到蛋白質(zhì)變性的程度時，酶就被鈍化。傳統(tǒng)熱加工的優(yōu)勢在于技術(shù)原理簡單、鈍酶效果較好、配套工藝和設(shè)備成熟，因此目前在產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用最廣泛；但其缺陷也明顯，主要表現(xiàn)為容易造成食品品質(zhì)劣變，不利于加工高品質(zhì)果蔬制品，而隨著我國消費市場的升級，人們對高品質(zhì)果蔬食品的需求快速增加，此類熱加工工藝的弊端逐漸被放大。 微波加熱目前已被廣泛應(yīng)用于食品的鈍酶處理，與傳統(tǒng)熱加工相比，微波處理時間更短，造成的營養(yǎng)和新鮮品質(zhì)損失更少。除了熱效應(yīng)以外，微波產(chǎn)生的電磁效應(yīng)也可能會對PME中的帶電氨基酸以及環(huán)境中的帶電離子產(chǎn)生影響。此外，雖然微波的能量一般不足以破壞PME的共價鍵，但某些非共價鍵的（如疏水鍵和氫鍵等）破壞也會造成酶蛋白的去折疊乃至變性失活。因此，相比于傳統(tǒng)熱加工，處理速度快、鈍酶效果好是微波加熱突出的優(yōu)點，非常適合應(yīng)用于不耐貯藏、需要快速處理的原料，同時可以更好地保留食品原有的新鮮品質(zhì)。 歐姆加熱又稱焦耳加熱，是利用物料本身的電阻特性直接將電能轉(zhuǎn)化為熱能的一種加熱方式，其優(yōu)點是加熱迅速均勻、系統(tǒng)設(shè)計緊湊、能量傳遞效率高。歐姆加熱處理中物料電導(dǎo)率、處理時間、溫度以及處理強度（主要是電場強度和頻率）是影響鈍酶效果的關(guān)鍵因素。與微波加熱類似，歐姆加熱比傳統(tǒng)熱加工的能量轉(zhuǎn)換效率更高，可以更加快速地達到鈍酶效果并保持食品的色澤和營養(yǎng)，尤其適合應(yīng)用于連續(xù)的液體或固液混合物；但其缺點是目前在產(chǎn)業(yè)化中的應(yīng)用還存在一定挑戰(zhàn)。高靜壓
高靜壓是指通過將食品密封在柔性容器內(nèi)，以水或其他液體作為傳壓介質(zhì)，在常溫或溫和加熱條件下，施加不低于100 MPa的壓力并維持一定時間，以達到殺菌、鈍酶、改善食品功能性質(zhì)的目的。高靜壓技術(shù)是目前商業(yè)化應(yīng)用最成功的非熱加工技術(shù)，已經(jīng)在果蔬汁/漿、鮮切果蔬等產(chǎn)品中成功應(yīng)用。然而，由于耐壓型PME的廣泛存在以及環(huán)境中糖等物質(zhì)的保護，除了少數(shù)食品體系以外，常規(guī)的高靜壓處理在多數(shù)情況下對食品中PME的鈍化效果不夠理想，往往造成產(chǎn)品在貯藏期間的沉淀、軟化、析水等品質(zhì)劣變，需要較高強度或者較長處理時間才能達到生產(chǎn)要求，或者采取與溫度處理結(jié)合的方式，這意味著對設(shè)備要求的提高和生產(chǎn)成本的增加。因此，更加簡單經(jīng)濟的柵欄技術(shù)與超高壓結(jié)合成為一個極具前景的發(fā)展方向，例如天然PME抑制劑與超高壓技術(shù)的協(xié)同應(yīng)用。 傳統(tǒng)均質(zhì)處理的壓力一般為20～60 MPa，而60 MPa以上的均質(zhì)處理稱為超高壓均質(zhì)，又稱動態(tài)高壓，適合流體食品的連續(xù)加工。超高壓均質(zhì)處理過的果蔬汁仍含有較高的PME殘余活性，但它們明顯更穩(wěn)定。這一方面歸因于超高壓均質(zhì)對果膠結(jié)構(gòu)的改變，使得底物對PME的可用性降低；另一方面歸因于均質(zhì)化處理所產(chǎn)生的壓力、剪切力、空穴效應(yīng)等導(dǎo)致果蔬汁懸浮顆粒尺寸減小，破碎細胞釋放出了細胞壁成分（如果膠、蛋白質(zhì)），提高了顆粒之間、顆粒與果蔬汁清液之間的相互作用，進而維持了渾濁體系的穩(wěn)定性。 脈沖電場是一種近年來已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于液體食品的加工方法，其相對較低的加工溫度和較短的處理時間可以在保持產(chǎn)品品質(zhì)的同時實現(xiàn)內(nèi)源酶的高效鈍化。外部電場的施加和變化可能會影響酶蛋白的局部靜電場，并破壞肽鏈的靜電相互作用，從而導(dǎo)致酶的構(gòu)象變化。脈沖電場的鈍酶效果顯著，非常適合于對熱敏性液體物料的處理，但是由于設(shè)備、成本等因素的限制，距離規(guī)模化商業(yè)應(yīng)用仍有一定的差距。 高壓二氧化碳技術(shù)（HPCD）是一種結(jié)合壓力和二氧化碳作用的非熱加工方式，處理過程中形成高壓、高酸、無氧環(huán)境，可以達到有效殺菌鈍酶的效果。HPCD同樣能夠引起酶蛋白結(jié)構(gòu)的變化，與輕度熱處理引起的變化也有顯著差異，且檢測到的結(jié)構(gòu)變化與觀察到的酶活性損失相關(guān)。PME還可以與CO2相互作用形成碳酸氫鹽絡(luò)合物，從而喪失與底物結(jié)合的能力。與脈沖電場類似，由于設(shè)備、成本等因素限制，高壓二氧化碳技術(shù)的規(guī)模化商業(yè)應(yīng)用存在難度。 除了加工引起PME失活之外，添加外源抑制劑可能是抑制PME活性的另一種具有應(yīng)用前景的方法。當前已經(jīng)報道的PME抑制劑主要包括蛋白類、多酚類和一些其他小分子物質(zhì)，根據(jù)抑制類型可以劃分為競爭性抑制劑、非競爭性抑制劑和混合型抑制劑等。其中競爭性抑制是指抑制劑能夠通過與底物酶競爭活性位點，阻礙底物與酶的結(jié)合；非競爭性抑制是指抑制劑與酶的非活性部位相結(jié)合，形成抑制劑-酶的絡(luò)合物后影響酶對底物的結(jié)合能力，一般情況下非競爭性抑制的抑制能力較弱。PEM抑制劑（PME inhibitor，PMEI）的分類、抑制效果及機理如表2所示。
PMEI最初在獼猴桃果實中發(fā)現(xiàn)，后來在檸檬、木薯等多種植物中也發(fā)現(xiàn)了具有編碼同類型功能蛋白的基因，這意味著植物可以通過表達高度專一化的抑制劑來調(diào)控PME活性。獼猴桃PMEI及其與PME形成的復(fù)合物如圖2所示。晶體結(jié)構(gòu)顯示獼猴桃PMEI通過與PME相對較寬的果膠活性位點縫隙直接接觸而抑制，覆蓋結(jié)合位點接入點，從而阻止底物結(jié)合。PMEI與PME形成復(fù)合物時的相互作用是非共價作用力，且這種結(jié)合是可逆的。pH值環(huán)境對復(fù)合物的穩(wěn)定性影響較大，不同植物源PMEI的實際效果不同，一般情況下當處于接近生理pH值環(huán)境時，PMEI與PME間的親和力最高。PMEI抑制植物PME的作用不具有種間特異性，可以抑制大部分植物來源的PME，但是對細菌和真菌來源的微生物PME沒有抑制活性，這反映出PME結(jié)構(gòu)差異影響了其與抑制劑的相互作用。將PMEI應(yīng)用于果蔬加工具有深遠的發(fā)展前景，不僅可以有效降低加工所需的處理強度，而且可以更大程度地保留產(chǎn)品原本的新鮮品質(zhì)。
酚類物質(zhì)是植物所產(chǎn)生的一類次生代謝物質(zhì)，酚類及其氧化物與氨基酸的縮合物可被用于控制一些酶系的活性，從而在病原侵染時起到防御作用。通過外源添加一些天然多酚成分，在抑制PME活性的同時，多酚自身具有的抗氧化等生理活性也進一步提升了產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。當前已報道的具有PME抑制效果的多酚種類十分有限，今后在這方面仍有必要進行更多的探索。
除來源于植物中的蛋白、多酚類抑制劑外，也有研究者通過化學(xué)文庫篩選的方式鑒定出109 種針對商業(yè)橘皮PME的潛在抑制劑，包括磺胺類、萘醌類、胺類和帶唑基的分子等。然而，這些物質(zhì)大多數(shù)具有一定刺激性或者毒性，不能被添加到食品當中。近年來，由于人們食品安全和健康意識的不斷覺醒，一些人工合成的酶抑制劑會逐漸被淘汰，與之對應(yīng)的是，一些天然來源、綠色安全的天然成分會越來越多地得到人們的認可，對于天然成分功能的不斷開發(fā)和應(yīng)用將成為未來的發(fā)展趨勢。04 不同加工方式聯(lián)合處理對PME活性的影響
熱與非熱加工聯(lián)合處理對PME活性的影響
在常溫條件下，單獨的非熱加工處理對PME活力的影響往往是有限的，而溫度條件對于鈍酶效果影響顯著。因此，通過溫和的熱處理與非熱加工的組合可以對酶的抑制起到協(xié)同作用，同時也能夠相對更好地保留產(chǎn)品品質(zhì)。熱、非熱加工與抑制劑聯(lián)合處理對PME活性的影響 除了加工方式的聯(lián)合以外，將熱或者非熱加工與酶抑制劑相結(jié)合的策略也是一種有望實現(xiàn)對PME活力充分抑制的可能途徑。研究表明，PME-PMEⅠ絡(luò)合物不受溫度（65 ℃）和溫和壓力（400 MPa）的影響，這為溫和熱處理或壓力條件下有效抑制PME提供了可能性。與加工方式的聯(lián)合相比，酶抑制劑與加工方式的結(jié)合具有操作簡單、對生產(chǎn)線改造要求低/更容易實現(xiàn)、成本更低等優(yōu)勢，非常適合目前傳統(tǒng)加工企業(yè)的技術(shù)升級，因此在技術(shù)應(yīng)用推廣中具有更好的前景。 對于PME活性的有效抑制是果蔬加工中的關(guān)鍵工藝之一，能夠嚴重影響果蔬汁、泥、醬等產(chǎn)品在貯藏期間的品質(zhì)穩(wěn)定性。由于傳統(tǒng)熱加工輸入的能量較高，甚至能夠斷裂共價鍵進而影響PME的一級結(jié)構(gòu)及催化活性。為了盡量減輕該過程中對產(chǎn)品風(fēng)味、營養(yǎng)等成分造成的不利影響，一些新型熱加工及非熱加工技術(shù)被探索并應(yīng)用于PME的抑制。相比于處理強度更為劇烈的熱加工，非熱加工主要是基于對PME酶蛋白二、三級結(jié)構(gòu)的改變，從而影響其對底物的結(jié)合能力，最終導(dǎo)致其催化活性降低。其中，作為目前商業(yè)應(yīng)用最為廣泛和成功的非熱加工技術(shù)，高靜壓處理具有巨大的發(fā)展?jié)摿Α４送猓垣J猴桃PMEI和一些多酚類為代表的天然抑制劑也可以通過競爭活性位點、改變空間構(gòu)象等方式對PME活性起到一定的抑制效果。不同加工方式對PME的抑制機理如圖3所示。
然而，由于食物復(fù)雜基質(zhì)對PME的保護效應(yīng)，以及一些耐熱和耐壓PME同工酶的存在，使得單獨的物理加工手段對PME的影響有限。因此，未來更有可能是通過評估更多聯(lián)合處理以及類似柵欄技術(shù)的優(yōu)化策略，從而實現(xiàn)對PME活性的充分抑制。同時，觀察到的協(xié)同作用也有助于減少由于使用過高濃度天然抑制劑或劇烈加工處理條件所引起的食品品質(zhì)劣變。
本文《果蔬加工中果膠甲基酯酶活性抑制的研究進展》來源于《食品科學(xué)》2023年44卷第9期321-330頁，作者：劉一璇，田學(xué)智，趙 靚，王永濤*，廖小軍。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220526-319。
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