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FSHW | 4-羥基肉桂酸通過誘導(dǎo)質(zhì)膜氧化還原酶的表達和改善線粒體功能來減輕神經(jīng)元細(xì)胞死亡

Introduction

神經(jīng)退行性疾病是一類與年齡相關(guān)的疾病，包括阿爾茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS），其特點是神經(jīng)結(jié)構(gòu)和功能的退化，導(dǎo)致認(rèn)知障礙和運動改變等癥狀。現(xiàn)有的治療方法包括乙酰膽堿酯酶抑制劑和N-甲基-D-天門冬氨酸受體拮抗劑，但維持氧化還原平衡成為新的研究方向。目前，許多關(guān)于神經(jīng)退行性疾病治療的研究都集中在維持氧化還原穩(wěn)態(tài)上，因為氧化/硝化應(yīng)激以及基因突變可以增強蛋白質(zhì)聚集體的產(chǎn)生。此外，線粒體功能失調(diào)和蛋白質(zhì)聚集體的形成可由外部應(yīng)激源(如污染、陽光、吸煙等)和內(nèi)部因素(如自由基的代謝產(chǎn)生)誘導(dǎo)。線粒體功能障礙通常在神經(jīng)退行性疾病的早期發(fā)現(xiàn)，并通過引起ATP缺乏和改變ATP依賴的生化級聯(lián)反應(yīng)，促進這些退行性過程的進展。受損的線粒體表現(xiàn)為谷胱甘肽過氧化物酶活性降低和谷胱甘肽水平降低。此外，線粒體DNA的突變和線粒體復(fù)合物I、II、III和IV的缺陷已在多種神經(jīng)退行性疾病和衰老過程中被發(fā)現(xiàn)。既有的治療方式在保持氧化還原平衡方面存在問題，需要研究新的方法解決該治療方式存在的問題。

4-羥基肉桂酸(HCA)(圖1A)，又稱對香豆酸，是由肉桂酸(圖1B)通過4-肉桂酸羥化酶或酪氨酸解氨酶由l-酪氨酸(圖1C)合成的一種植物化學(xué)物質(zhì)，存在于花生、西紅柿、羅勒和胡蘿卜等多種可食用植物中。目前，關(guān)于HCA是否可以保護與線粒體功能增強相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞尚未得到研究。

圖1 HCA及其前體的化學(xué)結(jié)構(gòu):(A) HCA，(B)肉桂酸，(C) l -酪氨酸

本文通過研究4-羥基肉桂酸（HCA）在神經(jīng)元細(xì)胞線中調(diào)節(jié)線粒體功能的作用來解決當(dāng)前治療方法的不足。本研究通過分析兩種不同神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞存活率、異常蛋白水平和線粒體功能，探討了4-羥基肉桂酸(HCA)的神經(jīng)保護作用機制。HCA在氧化/代謝應(yīng)激條件下維持氧化還原穩(wěn)態(tài)和能量代謝。這些發(fā)現(xiàn)表明，HCA可能是一種有希望的治療神經(jīng)退行性疾病的方法。

Results and discussion

HCA誘導(dǎo)PM氧化還原酶表達，改變細(xì)胞氧化還原電位

分別培養(yǎng)了兩種不同的神經(jīng)細(xì)胞系SH-SY5Y和HT22，分別在HCA缺失和存在的情況下進行了免疫印跡分析，評估了它們的表達水平。在兩種細(xì)胞系中，HCA均以劑量依賴的方式增加NQO1的表達(圖2A和B)。相反，HCA沒有顯著增加SH-SY5Y細(xì)胞中b5R的表達(圖2C)。HCA作用下SH-SY5Y細(xì)胞中A b5R活性有升高的趨勢，但不顯著。然而，HCA誘導(dǎo)HT22細(xì)胞中b5R的表達呈劑量依賴性，與b5R活性的增加一致(P < 0.01)(圖2D)。經(jīng)HCA處理的SH-SY5Y細(xì)胞的NAD+/NADH比值較對照細(xì)胞顯著升高(約2~2.5倍)(P<0.01) (圖2E)。在與HCA孵育的HT22細(xì)胞中，也發(fā)現(xiàn)有更高的NAD+/NADH比率(約2~3倍)(P<0.01)(圖2F)。

圖2. 誘導(dǎo)PM氧化還原酶的SH-SY5Y和HT22細(xì)胞的特征。細(xì)胞在沒有或存在指示濃度(微摩爾)的HCA的情況下預(yù)先孵育24小時，用NQO1和b5R單抗對SH-SY5Y(A，C)和HT22細(xì)胞(B，D)的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析。進行了三個獨立的免疫印跡分析實驗。NQO1活性(A，B)是在有或沒有雙香豆素的情況下用全細(xì)胞裂解物測定的。用這些裂解產(chǎn)物評估B5R活性(C，D)和NAD+/NADH比率(E，F(xiàn))

HCA保護神經(jīng)細(xì)胞免受毒性損傷

利用圖3A和圖3B中的HCA和siRNA片段設(shè)計了不同的NQO1表達模型。為了研究線粒體功能障礙是否也可以被誘導(dǎo)的PM氧化還原酶所減輕，我們用魚藤酮(一種線粒體復(fù)合體I抑制劑)來誘導(dǎo)線粒體功能障礙。用魚藤酮處理SH-SY5Y和HT22細(xì)胞后，細(xì)胞存活率顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.01)(圖3C~F)。然而，NQO1的高表達提高了線粒體功能異常下的細(xì)胞存活率，克服了能量代謝的缺陷(圖3C~F)。將這兩個細(xì)胞暴露于Aβ1-42可降低代謝活性(P<0.0 1)，這一作用不能被HCA處理減弱(圖3G-J)。

圖3. 添加有毒物質(zhì)后，HCA對細(xì)胞活力的影響。免疫印跡法檢測Hca和siRNA作用24 h(A、B)后NQO1表達水平。細(xì)胞預(yù)先與HCA共同孵育后，暴露于指示毒性物質(zhì)(C-J)中24 h，臺盼藍(lán)拒染法(E，F(xiàn))和四甲基偶氮唑鹽比色法(C，D，G，H，I，J)檢測細(xì)胞存活率。

HCA延緩細(xì)胞凋亡

在正常培養(yǎng)條件下(即不含魚藤酮的培養(yǎng)液)，熒光顯微鏡顯示SH-SY5Y和HT22細(xì)胞均有輕微的細(xì)胞萎縮(P<0.01)(圖4A和圖B)。魚藤酮可加速細(xì)胞收縮(P<0.01)。添加HCA使細(xì)胞對魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)改變具有抵抗作用(P<0.01)(圖4A和B)。同樣，在正常培養(yǎng)條件下，兩個細(xì)胞都很少出現(xiàn)染色質(zhì)凝集(圖4C、D)。

圖4.魚藤酮治療后HCA對細(xì)胞凋亡特征的影響。加入魚藤酮24 h后，測定(A，C)SH-SY5Y；(B，D)HT22的細(xì)胞膜通透性(碘化丙啶陽性細(xì)胞)(A，B)和染色質(zhì)凝集(C，D)水平。

HCA可減輕氧化/硝化損傷

與對照細(xì)胞相比，預(yù)先與HCA孵育的細(xì)胞中的8-異前列腺素水平并沒有增加(圖5A和B)。在魚藤酮作用下，SH-SY5Y和HT22細(xì)胞的8-異前列腺素水平均顯著升高(P<0.01)，但這些水平可被HCA以劑量依賴的方式減弱(圖5A和B)。在正常培養(yǎng)條件下，HCA處理的SH-SY5Y細(xì)胞的蛋白質(zhì)羰基水平略低于對照細(xì)胞(圖5C和D)，這是蛋白質(zhì)氧化的標(biāo)志。在加入魚藤酮后，對照細(xì)胞的蛋白質(zhì)羰基水平顯著增加，且呈劑量依賴關(guān)系(P<0.01)，而暴露于HCA的細(xì)胞中這些水平顯著降低(P<0.01)(圖5C和D)。在加入魚藤酮后，對照組細(xì)胞中蛋白質(zhì)硝化的生物標(biāo)志物3-硝基酪氨酸水平也顯著增加(P<0.01)(圖5E和F)。然而，在HCA存在的情況下，這些水平在培養(yǎng)的細(xì)胞中降低(P<0.01)(圖5E和F)。

圖5在接觸魚藤酮后，HCA對脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化/硝化損傷水平的影響。(A，C，E)SH-SY5Y，(B，D，F(xiàn))HT22分別作用24 h后，用細(xì)胞提取液檢測8-異前列腺素(A，B)、蛋白質(zhì)羰基(C，D)和硝基酪氨酸(E，F(xiàn))水平。進行了六個獨立的氧化/硝化損傷檢測實驗。

HCA不是直接的ROS清理者

為了檢測HCA是否直接清除ROS，用過氧化氫進行了DPPH測定。在沒有細(xì)胞的情況下，HCA本身并不降低ROS水平，而α-生育酚直接降低ROS水平。經(jīng)魚藤酮處理后，SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生的ROS水平顯著增加(P<0.01)。在加入HCA的SH-SY5Y細(xì)胞中，上述水平較低(P<0.01)。然而，在添加2-DG后，這些水平?jīng)]有顯著變化。

HCA誘導(dǎo)的PM氧化還原酶抑制線粒體ROS的產(chǎn)生

在沒有線粒體抑制劑的情況下，加入HCA可以降低SH-SY5Y和HT22細(xì)胞中的ROS水平(圖6A-D)。經(jīng)魚藤酮處理后，兩種細(xì)胞的ROS產(chǎn)生水平均顯著升高(P<0.01)(圖6A和B)。然而，與未加入HCA的細(xì)胞相比，加入HCA后，兩種細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高均降低(P<0.01)(圖6A和圖B)。此外，在活細(xì)胞中，僅用魚藤酮處理的細(xì)胞線粒體超氧化物歧化水平升高，但經(jīng)HCA處理后線粒體超氧化物歧化水平降低(P<0.01)。S2E-H)。SH-SY5Y和HT22經(jīng)抗霉素A處理后，ROS水平也顯著升高(P<0.01)(圖6C和D)。但HCA的加入導(dǎo)致抗霉素A孵育的細(xì)胞產(chǎn)生較低水平的ROS(P<0.01)(圖6C和D)。

圖6. HCA對線粒體ROS產(chǎn)生的抑制作用。用HCA培養(yǎng)細(xì)胞，用離心法分離線粒體部分。在谷氨酸/蘋果酸(A，B)或琥珀酸(C，D)存在的情況下，評估線粒體ROS的產(chǎn)生。(A，C)SH-SY5Y；(B，D)HT22

HCA誘導(dǎo)的PM氧化還原酶促進線粒體功能

測定線粒體復(fù)合物I和II以及APR的活性，以研究PM氧化還原酶調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞線粒體功能的機制。當(dāng)在HCA存在下以劑量依賴性方式培養(yǎng)時，SH-SY5Y細(xì)胞中的線粒體復(fù)合物I活性顯著增加(P<0.01)（圖7A）。暴露于魚藤酮后，線粒體復(fù)合物I活性顯著降低（P<0.01);然而，復(fù)合物I活性的抑制通過用HCA培養(yǎng)SH-SY5Y細(xì)胞而減弱(P<0.01)（圖7A）。補充HCA的SH-SY5Y細(xì)胞中的復(fù)合物II活性也高于對照細(xì)胞(P<0.01)（圖7C）。用魚藤酮處理SH-SY5Y細(xì)胞往往會降低復(fù)合物II的活性，但并不顯著（圖7C）。隨著線粒體復(fù)合物I和II活性的增強，APR在HCA培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞中也以劑量依賴性方式顯著增加（P<0.01）（圖7E).添加魚藤酮后SH-SY5Y細(xì)胞中的APR降低，但在HCA存在下通過孵育減弱(P<0.01)（圖7E）。類似地，HCA使HT22細(xì)胞中復(fù)合物I和II的活性高于正常培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的對照細(xì)胞（圖7B和D）。魚藤酮降低了HT22細(xì)胞中的復(fù)合物I活性(P<0.01)，但通過用HCA培養(yǎng)細(xì)胞，復(fù)合物I活性降低了(P<0.01)（圖7B）。HCA也增加了HT22細(xì)胞中的復(fù)合物II活性(P<0.01)，但活性沒有被魚藤酮顯著改變(圖7)D).APR在HT22細(xì)胞與魚藤酮一起孵育后降低，加入HCA后APR大大升高（圖7F）。

圖7.HCA對線粒體功能的刺激。細(xì)胞與HCA預(yù)孵育，然后通過離心分離分離線粒體部分。在存在谷氨酸/蘋果酸（A、B）和琥珀酸（C、D）的情況下測量線粒體復(fù)合物I和II的活性。還使用相同的電子供體谷氨酸/蘋果酸(E)或琥珀酸(F)確定APR。(A,C,E)SH-SY5Y；（B、D、F）HT22。

HCA刺激線粒體融合并抑制線粒體分裂

監(jiān)測Opa1和Mfn1（線粒體融合的生物標(biāo)志物）和Drp1（線粒體裂變的標(biāo)志物）以闡明NQO1或b5R的誘導(dǎo)調(diào)節(jié)線粒體伸長和斷裂過程的機制。與正常培養(yǎng)條件下的對照細(xì)胞相比，補充HCA的SH-SY5Y細(xì)胞中Opa1和Mfn1的水平以劑量依賴性方式顯著升高（圖8A）。相反，SH-SY5Y細(xì)胞中的Drp1水平因暴露于HCA而顯著降低（圖8A）。類似地，用HCA處理HT22細(xì)胞會誘導(dǎo)更高的Opa1和Mfn1表達以及更低水平的Drp1（圖8B）。

圖8.HCA對線粒體融合和裂變過程的影響。細(xì)胞與HCA一起培養(yǎng)，SH-SY5Y(A)和HT22細(xì)胞(B)的裂解物分別使用針對OPA1、Mfn1和Drp1的抗體通過免疫印跡分析進行評估。進行了三個獨立的免疫印跡分析實驗。

Conclusion

HCA是一種對線粒體功能具有神經(jīng)保護作用的藥物，可誘導(dǎo)PM氧化還原酶的表達并提高線粒體的復(fù)合物活性，從而降低線粒體的氧化和硝化應(yīng)答，提高細(xì)胞存活率。因此，HCA可能是治療神經(jīng)退行性疾病的有效方法之一。

此文獻探討了4-羥基肉桂酸(HCA)的潛在神經(jīng)保護作用，HCA是一種在多種食物和藥物內(nèi)合成的植物化學(xué)物質(zhì)，具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的保護作用，對與氧化損傷相關(guān)的疾病如腦缺血再灌注損傷、II型糖尿病、肥胖等具有保護作用。本研究旨在研究HCA在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的線粒體功能方面的作用。作者使用SH-SY5Y人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系和HT22小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系培養(yǎng)24小時，評估HCA對有毒損害中PM氧化還原酶的表達和線粒體功能的神經(jīng)保護作用。實驗結(jié)果顯示，HCA可誘導(dǎo)NQO1和b5R的表達，調(diào)節(jié)線粒體復(fù)合物、提高神經(jīng)元對有毒刺激的存活能力和降低對細(xì)胞的氧化和硝化應(yīng)答，可能通過提高細(xì)胞能量代謝和氧化還原狀態(tài)，提高細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的能力，改善線粒體功能。本文研究還顯示，HCA能夠通過調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂等方式，維持線粒體結(jié)構(gòu)和正常功能。本研究表明，HCA是一種潛在的對線粒體功能具有神經(jīng)保護作用的藥物，在治療神經(jīng)退行性疾病中具有潛在治療價值。

4-Hydroxycinnamic acid attenuates neuronal cell death by inducing expression of plasma membrane redox enzymes and improving mitochondrial functions

Sujin Park^a,1, Yoon A Kim^a,1, Jaewang Lee^a, Hyunsoo Seo^a, Sang-Jip Nam^b, Dong-Gyu Jo^c, Dong-Hoon Hyun^a,^*

^a Department of Life Science, Ewha Womans University, Seoul 03760, South Korea

^b Department of Chemistry and Nano Science, Ewha Womans University, Seoul 03760, South Korea

^c School of Pharmacy, Sungkyunkwan University, Suwon 16419, South Korea

*Corresponding authors.

Abstract

Many approaches to neurodegenerative diseases that focus on amyloid-β clearance and gene therapy have not been successful. Some therapeutic applications focus on enhancing neuronal cell survival during the pathogenesis of neurodegenerative diseases, including mitochondrial dysfunction. Plasma membrane (PM) redox enzymes are crucial in maintaining cellular physiology and redox homeostasis in response to mitochondrial dysfunction. Neurohormetic phytochemicals are known to induce the expression of detoxifying enzymes under stress conditions. In this study, mechanisms of neuroprotective effects of 4-hydroxycinnamic acid (HCA) were examined by analyzing cell survival, levels of abnormal proteins, and mitochondrial functions in two different neuronal cells. HCA protected two neuronal cells exhibited high expression of PM redox enzymes and the consequent increase in the NAD+/NADH ratio. Cells cultured with HCA showed delayed apoptosis and decreased oxidative/nitrative damage accompanied by decreased ROS production in the mitochondria. HCA increased the mitochondrial complexes I and II activities and ATP production. Also, HCA increased mitochondrial fusion and decreased mitochondrial fission. Overall, HCA maintains redox homeostasis and energy metabolism under oxidative/metabolic stress conditions. These findings suggest that HCA could be a promising therapeutic approach for neurodegenerative diseases.

Reference:

PARK S, KIM Y A, LEE J, et al. 4-Hydroxycinnamic acid attenuates neuronal cell death by inducing expression of plasma membrane redox enzymes and improving mitochondrial functions[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(4): 1287-1299. DOI:10.1016/j.fshw.2022.10.011.