噬菌體是侵襲細(xì)菌的病毒，寄生于活菌體內(nèi)，在自然界中廣泛分布。將噬菌體合理地應(yīng)用于食品工業(yè)中，能夠?qū)Ｒ坏貧绨退幘趦?nèi)的特定菌株，而不對(duì)其他細(xì)菌造成任何影響。噬菌體可彌補(bǔ)傳統(tǒng)抗生素及殺菌技術(shù)的不足，在控制食源性致病菌的污染方面具有良好的應(yīng)用前景。 在“農(nóng)場(chǎng)-餐桌”的食品供應(yīng)鏈中，大量研究報(bào)告了噬菌體能夠有效抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)，且不會(huì)影響食品的感官特征。但噬菌體在食品工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用相對(duì)較少，其原因主要包括一些技術(shù)的限制和消費(fèi)者的接受程度。因此，需要進(jìn)一步評(píng)估噬菌體的安全性和有效性，以確保它們?cè)谑称饭I(yè)中安全、高效的使用。 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院的惠瀟然，黃振華，張昭寰*等系統(tǒng)地綜述了限制噬菌體在食品領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用的原因，涵蓋了噬菌體在食品工業(yè)中應(yīng)用的可接受程度、潛在耐藥傳播風(fēng)險(xiǎn)、細(xì)菌的噬菌體抗性問題、復(fù)雜的食品基質(zhì)對(duì)其作用效果的影響，并對(duì)噬菌體在食品工業(yè)中的應(yīng)用方式提出了科學(xué)合理的建議，以推動(dòng)噬箘體的基礎(chǔ)研究走向食品工業(yè)的實(shí)際應(yīng)用。
1 噬菌體在食品工業(yè)中應(yīng)用的可接受程度
噬菌體在食品及食品相關(guān)環(huán)境中的殺菌效果得到了廣泛的研究，可抑制多種食物中的致病菌和腐敗菌，如水果、蔬菜、肉制品、乳制品和水產(chǎn)品等。2006年，美國(guó)食品和藥品管理局（FDA）推出第一款可用于食品工業(yè)的噬菌體產(chǎn)品ListShieldTM，用于即食食品肉類和家禽產(chǎn)品中單核細(xì)胞增生李斯特菌（以下簡(jiǎn)稱單增李斯特菌）（Listeria monocytogenes）的控制。國(guó)內(nèi)對(duì)噬菌體的研究主要集中在臨床醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)方面。在食品工業(yè)中，對(duì)噬菌體的應(yīng)用研究主要集中在對(duì)肉質(zhì)品中的食源性致病菌的控制。目前我國(guó)還未批準(zhǔn)相關(guān)應(yīng)用于食品的噬菌體產(chǎn)品，這與消費(fèi)者對(duì)噬菌體應(yīng)用于食品的可接受程度密切相關(guān)。 相對(duì)于新興技術(shù)加工的食品而言，多數(shù)消費(fèi)者更加傾向于傳統(tǒng)技術(shù)加工的食品。盡管利用噬菌體殺菌是一種綠色、安全和靶向的抗菌手段，但其作用方式是在食品表面噴灑“病毒活體”，導(dǎo)致廣大消費(fèi)者對(duì)這種殺菌技術(shù)的接受程度較低。病毒在普通大眾的固有觀念中是有害的，所以消費(fèi)者很難接受應(yīng)用噬菌體技術(shù)加工的產(chǎn)品。盡管噬菌體技術(shù)背后的科學(xué)原理十分明確，但消費(fèi)者對(duì)于未知事物的不了解甚至誤解，某種程度上限制了噬菌體在食品工業(yè)中的應(yīng)用。2 噬菌體傳播耐藥性的潛在風(fēng)險(xiǎn)
近年來，人們?cè)谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中抗生素的濫用問題，促使大量抗生素通過農(nóng)業(yè)廢棄物釋放到環(huán)境中，對(duì)微生物群落造成選擇性壓力，從而導(dǎo)致了耐藥菌和耐藥基因的選擇和傳播。目前，來源于各類水體、土壤、畜禽以及人體糞便分離的噬菌體中，均檢測(cè)出不同種類的抗生素耐藥基因（ARGs），如β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、甲氧西林、磺胺類等。如表1所示，噬菌體攜帶了較高水平的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因（主要集中于blaTEM和blaCTX類）和喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB和qnrS，以及一些其他的耐藥基因，如磺胺類耐藥基因sul1和sul2、四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetW和tetM以及萬古霉素耐藥基因vanA等。隨著測(cè)序手段的進(jìn)步，研究人員利用宏基因組學(xué)的方法同樣也檢測(cè)到了噬菌體攜帶各種ARGs，這表明噬菌體可以被視為一種ARGs的儲(chǔ)存庫(kù)。
研究發(fā)現(xiàn)，大約20%的細(xì)菌基因組是通過噬菌體樣元件而獲得，其介導(dǎo)細(xì)菌間基因轉(zhuǎn)移的主要方式為轉(zhuǎn)導(dǎo)或溶源轉(zhuǎn)變。轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過噬菌體介導(dǎo)外源DNA轉(zhuǎn)移的過程，攜帶耐藥基因的噬菌體感染細(xì)菌后，可能會(huì)將耐藥基因重組到感染細(xì)菌的基因組中，從而使其獲得新的遺傳特性。溶源性轉(zhuǎn)變是指溫和型噬菌體基因組在宿主基因中的整合，當(dāng)溫和型噬菌體感染細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，噬菌體DNA整合到宿主細(xì)胞染色體上，此時(shí)原噬菌體基因的表達(dá)將導(dǎo)致宿主表型的變化，形成的溶原細(xì)胞可以在不產(chǎn)生噬菌體顆粒或有害噬菌體蛋白的情況下生存。因此，噬菌體能夠在ARGs的傳播中發(fā)揮重要的作用，造成細(xì)菌耐藥性傳播的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在食品工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。 在噬菌體應(yīng)用研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌的噬菌體抗性問題使得噬菌體在食品工業(yè)的生物防治效果明顯降低。尤其是在控制食源性致病菌方面，在噬菌體與細(xì)菌不斷進(jìn)化的過程中，細(xì)菌抵抗噬菌體的能力也在不斷地提升，從而導(dǎo)致噬菌體用于抑制細(xì)菌的效果并不理想，這大大限制了噬菌體在食品工業(yè)中的應(yīng)用。 噬菌體生物防治只能在短期內(nèi)抑制食源性致病菌的生長(zhǎng)，不久之后細(xì)菌可恢復(fù)生長(zhǎng)（表2）。很多研究均報(bào)道了噬菌體只可短期內(nèi)有效降低食品中致病菌的數(shù)量，而不能夠完全清除。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是出現(xiàn)了抗噬菌體突變株，使噬菌體無法徹底殺滅細(xì)菌。
3.2 細(xì)菌對(duì)噬菌體的抗性機(jī)制
在應(yīng)對(duì)噬菌體侵襲的過程中，食源性致病菌進(jìn)化了各種免疫系統(tǒng)來抵御噬菌體的感染，主要有吸附抑制（AI）系統(tǒng)、超感染排斥（Sie）系統(tǒng)、限制修飾（RM）系統(tǒng)、CRISPR-Cas系統(tǒng)、流產(chǎn)感染（Abi）系統(tǒng)和毒素-抗毒素（TA）系統(tǒng)（圖1）。
阻止噬菌體的吸附（AI系統(tǒng)）
噬菌體的吸附是噬菌體感染細(xì)菌的第一步（圖1）。噬菌體感染成功的關(guān)鍵是噬菌體與細(xì)菌表面受體特異性結(jié)合，因此受體變異就會(huì)使噬菌體無法吸附，從而導(dǎo)致噬菌體感染失敗。在長(zhǎng)期進(jìn)化中，細(xì)菌已經(jīng)進(jìn)化出許多表面結(jié)構(gòu)來阻止噬菌體的吸附，這一阻斷機(jī)制主要包括：噬菌體受體基因突變或修飾、競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的競(jìng)爭(zhēng)抑制、胞外基質(zhì)的覆蓋、噬菌體自身編碼的蛋白與其受體蛋白結(jié)合。
噬菌體DNA的侵入是噬菌體感染細(xì)菌的第二步（圖1）。Sie系統(tǒng)最初在溫和噬菌體中被發(fā)現(xiàn)，是阻止噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞的主要機(jī)制，當(dāng)宿主細(xì)胞被噬菌體感染后，同一類噬菌體再次感染宿主細(xì)胞時(shí)，這種多為膜錨定蛋白或與膜成分相關(guān)蛋白就會(huì)發(fā)揮作用，從而阻止同類噬菌體的再次感染。切割噬菌體DNA（RM系統(tǒng)和CRISPR-Cas系統(tǒng)） 噬菌體的生物合成是噬菌體感染細(xì)菌的第三步（圖1），RM系統(tǒng)普遍存在于細(xì)菌與古細(xì)菌的噬菌體防御機(jī)制中，該系統(tǒng)主要由MTase和REase組成。在噬菌體在完成吸附和侵入后，RM系統(tǒng)作為免疫系統(tǒng)攻擊進(jìn)入細(xì)胞的噬菌體DNA，其中REase主要識(shí)別并切割特異DNA序列，當(dāng)噬菌體DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，REase會(huì)識(shí)別并切割特定的位點(diǎn)，破壞噬菌體DNA，而宿主細(xì)胞DNA上的相同位點(diǎn)則被MTase甲基化，以保護(hù)自身DNA不被REase切割。RM系統(tǒng)根據(jù)作用機(jī)制和亞基可成分為4 種類型，即I～I(xiàn)V型。I型和III型RM系統(tǒng)相似，REase都沿著DNA移位，并從識(shí)別位點(diǎn)切割，在II型RM系統(tǒng)中，REase在DNA識(shí)別位點(diǎn)內(nèi)部或附近進(jìn)行切割，IV型系統(tǒng)由于缺乏MTase，只能切割修飾過的DNA。最近發(fā)現(xiàn)的一種新的防御系統(tǒng)——限制-修改相關(guān)的防御島系統(tǒng)（DISARM）能限制噬菌體的DNA進(jìn)入，類似于RM系統(tǒng)，是一種新型的多基因限制性修飾模塊。
CRISPR-Cas系統(tǒng)是由一個(gè)含有短且保守的重復(fù)序列的CRISPR基因組位點(diǎn)以及由Cas編碼的Cas蛋白組成。到目前為止，CRISPR-Cas系統(tǒng)一共可分為兩大類（一類是由多個(gè)蛋白組成的效應(yīng)蛋白模塊；另一類是單個(gè)蛋白效應(yīng)模塊），共有6 種類型（I～VI型）和33 種亞型。噬菌體在完成吸附和侵入后（圖1），該系統(tǒng)通過識(shí)別和切割外源的DNA或RNA，以一種序列特異性發(fā)揮作用，其行使功能分為3 個(gè)階段：獲取間隔序列、crRNA的生物合成和目標(biāo)干擾。當(dāng)噬菌體DNA第一次進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞時(shí)，兩種蛋白質(zhì)Cas1-Cas2復(fù)合物會(huì)選擇一部分外源DNA序列（原間隔序列）納入CRISPR序列中，形成一段新的間隔序列，這一過程使宿主細(xì)胞記住噬菌體的DNA。隨后這段間隔序列就會(huì)被轉(zhuǎn)錄成一個(gè)長(zhǎng)前體crRNA（pre-crRNA），該前體crRNA進(jìn)一步加工成含有噬菌體序列的成熟crRNA。最后在成熟的crRNA引導(dǎo)下，Cas核酸酶利用crRNA通過互補(bǔ)堿基配對(duì)來識(shí)別和切割噬菌體的DNA。
阻止噬菌體顆粒釋放（Abi系統(tǒng)和TA系統(tǒng)） 噬菌體的組裝和釋放是噬菌體感染細(xì)菌的第四步（圖1），當(dāng)噬菌體DNA成功入侵后，Abi系統(tǒng)能夠干擾噬菌體復(fù)制周期的各個(gè)環(huán)節(jié)，阻止子代噬菌體的釋放，同時(shí)導(dǎo)致宿主細(xì)胞的死亡。該系統(tǒng)主要是由單一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合物組成，通常在噬菌體侵入后被活化，是單個(gè)細(xì)菌為保護(hù)周圍細(xì)菌的一種自我犧牲的過程，主要通過干擾細(xì)菌細(xì)胞DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯來實(shí)現(xiàn)。Abi系統(tǒng)種類較多，在乳酸乳球菌中發(fā)現(xiàn)有20 種Abi系統(tǒng)（AbiA～AbiZ）。 TA系統(tǒng)廣泛存在于細(xì)菌中，主要依靠一個(gè)毒素和一個(gè)抗毒素組成的防御系統(tǒng)。該系統(tǒng)的基本特點(diǎn)是抗毒素具有不穩(wěn)定性，必須連續(xù)表達(dá)才能與毒素保持適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)計(jì)量比。TA系統(tǒng)中的毒素包括脫氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase），可以抑制DNA復(fù)制、ATP合成。以植物致病菌萎縮果膠桿菌為例（圖1），ToxI和ToxN組成了一個(gè)TA系統(tǒng)，其中ToxN可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，在噬菌體感染后導(dǎo)致ToxN釋放并降解細(xì)菌細(xì)胞RNA，導(dǎo)致噬菌體和細(xì)菌細(xì)胞死亡。4 復(fù)雜食品基質(zhì)對(duì)噬菌體作用效果的影響
在噬菌體應(yīng)用于食品工業(yè)的過程中，復(fù)雜的食品基質(zhì)也是影響噬菌體作用效果的重要因素，主要包括食品的pH值、溫度、化學(xué)成分等。這些因素往往是食品自身的固有屬性，很難通過工藝優(yōu)化的方式進(jìn)行消除，限制了噬菌體在此類食品環(huán)境中的實(shí)際應(yīng)用。4.1 食品pH值對(duì)噬菌體作用效果的影響
食品pH值是影響噬菌體殺菌效果的重要參數(shù)之一，研究表明，噬菌體在蜜瓜上的應(yīng)用效果優(yōu)于蘋果，研究者認(rèn)為噬菌體的感染可能受到蘋果酸性的影響。 食品的溫度是影響噬菌體作用效果的另一因素，例如，在4、10 ℃和20 ℃條件下，用噬菌體P100處理接種4（lg（CFU/cm2））單增李斯特菌的干腌火腿片，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在4 ℃比條件下噬菌體的殺菌效果最好。用商業(yè)噬菌體混合制劑處理奶酪時(shí)，觀察到不同溫度對(duì)噬菌體的影響效果不同，在22 ℃下噬菌體殺滅單增李斯特菌的效果最好，比6 ℃條件下多殺滅0.79（lg（CFU/g））單增李斯特菌，但22 ℃不適合貯存奶酪，這種條件下會(huì)促進(jìn)霉菌和其他腐敗菌的生長(zhǎng)。4.3 食品中化學(xué)成分對(duì)噬菌體作用效果的影響
食品中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等化學(xué)成分會(huì)干擾噬菌體與特定宿主細(xì)胞受體之間的相互作用，從而影響噬菌體的作用效果。Gill等發(fā)現(xiàn)牛乳中的乳清蛋白因吸附在細(xì)菌細(xì)胞表面，阻斷了噬菌體的結(jié)合，從而影響噬菌體對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性。Garcia等在半脫脂牛奶和全脂牛奶中檢測(cè)了噬菌體對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)噬菌體ΦH5和ΦA(chǔ)72混合處理后，半脫脂牛奶中的金黃色葡萄球菌數(shù)量下降了2（lg（CFU/mL）），而對(duì)全脂牛奶中的金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑制作用。 噬菌體在食品工業(yè)中應(yīng)用的可接受程度較低，其本身還具有潛在傳播耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，在控制食源性致病菌時(shí)，細(xì)菌對(duì)噬菌體產(chǎn)生的抗性問題以及復(fù)雜的食品基質(zhì)對(duì)其作用效果的影響等諸多問題限制了噬菌體在食品工業(yè)中的實(shí)際應(yīng)用。但是，噬菌體具有易于分離、資源豐富、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，若對(duì)其進(jìn)行合理的開發(fā)、提高應(yīng)用效率、控制潛在風(fēng)險(xiǎn)，能夠有助于突破其在食品工業(yè)應(yīng)用中的局限性。基于此，本文進(jìn)一步對(duì)噬菌體在食品工業(yè)中的發(fā)展及應(yīng)用提出以下三點(diǎn)建議。5.1 推動(dòng)噬菌體的基礎(chǔ)研究走向食品工業(yè)化應(yīng)用
基于大量關(guān)于噬菌體的基礎(chǔ)研究，向食品行業(yè)以及廣大消費(fèi)者進(jìn)行噬菌體的科普宣傳，使其充分了解噬菌體具有高效、安全、靶向等優(yōu)勢(shì)，并通過微信、短視頻等新興媒體，科學(xué)合理地普及噬菌體相關(guān)信息，提高噬菌體在食品工業(yè)應(yīng)用中的可接受度。此外，可根據(jù)每種噬菌體的最佳條件優(yōu)化食品工藝，在不影響食品風(fēng)味的情況下，使噬菌體在食品中發(fā)揮作用，從而推動(dòng)噬菌體的基礎(chǔ)研究走向食品工業(yè)化應(yīng)用。5.2 基于多組學(xué)技術(shù)嚴(yán)格篩選可用于食品加工的優(yōu)質(zhì)噬菌體菌種
噬菌體在自然界中普遍存在，將其作為生物防控劑應(yīng)用于食品時(shí)必須嚴(yán)格篩選，從基因組學(xué)、蛋白組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)上嚴(yán)格把控，篩選出不攜帶耐藥基因、毒力基因等風(fēng)險(xiǎn)因素的優(yōu)質(zhì)噬菌體菌種，為噬菌體在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，研發(fā)安全、高效的噬菌體類食品添加劑，從而為食品安全的切實(shí)保障提供可靠的防控策略。 大部分噬菌體都能編碼相應(yīng)的裂解酶，具有裂解活性強(qiáng)、安全性高、易于改造等優(yōu)勢(shì)，在食品實(shí)際生產(chǎn)過程中，可以使用噬菌體裂解酶代替噬菌體活體，其不僅具備噬菌體的特異性優(yōu)勢(shì)，而且不易改變食品的質(zhì)地和口感，能夠較好地克服噬菌體應(yīng)用的局限性。因此，今后可以將噬菌體裂解酶作為研究目標(biāo)，發(fā)掘出裂解活性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、宿主譜廣的噬菌體裂解酶，以應(yīng)用于食品工業(yè)領(lǐng)域。 本文《噬菌體在食品微生物安全領(lǐng)域中應(yīng)用的局限性和挑戰(zhàn)》來源于《食品科學(xué)》2023年44卷第13期338-345頁(yè)，作者：惠瀟然，黃振華，劉 靜，吳 倩，許天明，段為旦，潘迎捷，張昭寰，趙 勇。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20220623-249。
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