大豆中含有豐富的蛋白質(zhì)及多種人體必需氨基酸，是一種重要的植物性蛋白資源，常被加工成各種食品。然而，大豆在部分國家是優(yōu)先過敏原。據(jù)統(tǒng)計，大豆過敏影響了大約0.2%～0.4%的人群，其在兒童中的過敏率高達13%。大豆過敏是一種重要的食物過敏反應，會引發(fā)皮膚、呼吸道及消化道癥狀，如皮疹、蕁麻疹、哮喘、腹瀉、腹痛等，嚴重時可導致過敏性休克。

河南工業(yè)大學糧油食品學院邢玉飛，布冠好*，陳復生等對于大豆致敏蛋白特性的深入了解及研究快速、精確和標準化的過敏原檢測方法具有重要的實際意義。

Gly m Bd 30K，又稱P34，是一種半胱氨酸蛋白酶，廣泛存在于大豆細胞液泡中。Gly m Bd 30K是單體蛋白，其氨基酸數(shù)量為379 個，分子質(zhì)量為34 ku，屬于7S球蛋白，約占大豆總蛋白含量的1%，其結構如圖3所示。研究發(fā)現(xiàn)，66.5%的大豆過敏患者對Gly m Bd 30K識別并產(chǎn)生過敏反應，因此認為其屬于大豆中的主要致敏蛋白。同時，Gly m Bd 30K是一種糖蛋白，其N端170位氨基酸處是一個多糖鏈結合位點。蛋白質(zhì)的糖基化位置在其致敏性方面發(fā)揮重要作用，因此Gly m Bd 30K存在一定致敏性。

1.4 Gly m Bd 28K

2 檢測技術

根據(jù)識別物質(zhì)的不同，目前食品過敏原的檢測技術可分為基于蛋白水平和基于核酸水平的檢測技術。基于蛋白質(zhì)水平的檢測技術包括酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）、免疫印跡法（Western blotting）、免疫層析法、質(zhì)譜法及生物傳感器法；基于核酸水平的檢測技術有實時定量聚合酶鏈式反應（qPCR）、環(huán)介導等溫擴增（LAMP）技術。

2.1 基于蛋白水平的檢測技術

1 ）ELISA

ELISA基于抗原-抗體的特異性結合對過敏原進行免疫測定，通過間接指標對過敏原含量進行定性或定量檢測，不需要復雜或昂貴的設備。ELISA根據(jù)固定抗原方法的不同，可分為直接法和間接法，其中間接法包括夾心法及競爭法，不同ELISA方法的原理示意圖如圖5所示。夾心ELISA法檢測靈敏度明顯高于競爭性ELISA法，但更適合于未加工大豆蛋白的檢測，而競爭性ELISA法則更適合檢測加工后的大豆制品。基于單克隆抗體所建立的ELISA法檢測精準度高于基于多克隆抗體的ELISA法。

2） 免疫印跡法

免疫印跡法又稱蛋白質(zhì)印跡法，是基于抗體的特異性來鑒定抗原的有效檢測方法。首先進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），隨后將聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白質(zhì)樣品電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上。利用一抗作為“探針”，用標記的二抗進行“顯色”，對樣品進行檢測與分析，免疫印跡法的具體步驟及原理如圖6所示。免疫印跡法兼具電泳的高分辨力及免疫測定法的高特異性及敏感性等優(yōu)點，可用于抗原的定性和半定量檢測。相比于ELISA，免疫印跡法的靈敏度較低，對檢測樣品中的大豆過敏原僅能進行定性或半定量檢測，但是其可以追蹤不同食物加工階段產(chǎn)物中所有蛋白和肽段圖譜。此外，免疫印跡法可以有效避免由于蛋白抑制劑的存在導致的檢測結果假陰性現(xiàn)象。

3） 免疫層析法

免疫層析法基于抗原-抗體的特異性結合，首先將抗體預包被于硝化纖維素（NC）膜上，待測樣品通過毛細作用涌動到預包被抗體區(qū)域時被捕獲，使用酶標或膠體金作為檢測標志物，從而得到可視化結果，以纖維素膜上顯色條帶及其顏色的深淺等作為評價指標，從而實現(xiàn)過敏原的定性或定量檢測，檢測原理如圖7所示。相比于ELISA法，免疫層析法雖然檢測時間較短，但是其精準度較低。免疫層析法操作簡單、用時較短，通過增加檢測線（T線）可以進行高通量檢測。為了有效提高免疫層析法的靈敏度，未來可以將單克隆抗體與新型材料標志物如熒光量子點相結合。

4） 生物傳感器

生物傳感器通過生物識別元件識別并響應食物中的過敏原，再由換能器將其轉(zhuǎn)化為定量的光電信號來實現(xiàn)檢測，其工作原理如圖8所示。根據(jù)換能器的不同，生物傳感器可以分為光學生物傳感器、電化學生物傳感器及壓電傳感器三類。作為一類新的檢測方法，它具有快速、靈敏度高、自動化程度高、實時監(jiān)測等優(yōu)點，近年來已被廣泛應用于食物過敏原方面的檢測。生物傳感器技術兼具免疫檢測技術及光電技術的優(yōu)點，在大豆過敏原檢測中，選用最佳生物傳感器并擴大檢測范圍是未來的發(fā)展熱點之一。

5） 質(zhì)譜法

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法檢測的基本原理是樣品通過離子源從而被電離成不同帶電粒子，利用加速電場使帶電粒子進入質(zhì)量分析器，接著在電場及磁場的雙重作用下，將不同質(zhì)荷比（m/z）的離子分離并計算其分子質(zhì)量，最后通過計算機對蛋白質(zhì)或肽段進行鑒定分析，其工作原理如圖9所示。質(zhì)譜方法雖然克服了免疫學技術遇到的問題，即在食品加工處理后導致蛋白質(zhì)的結構發(fā)生變化后，無法有效、精準地檢測過敏原，但其需要使用昂貴的設備，維護成本很高，而且需要由訓練有素的人員操作。現(xiàn)階段，由于質(zhì)譜法具有檢測靈敏度高、檢測時間短、檢測用量少及可進行分離鑒定等特點，已廣泛應用于大豆過敏的檢測中。

2.2 基于核酸水平的檢測技術

1） qPCR

PCR技術是一種在體外將少量初始樣品中的目的基因進行大量擴增的核酸合成技術。隨著熒光化學物質(zhì)的發(fā)展，基于其熒光特性實時定量監(jiān)測擴增過程即為qPCR技術，其利用體外大量擴增的核酸產(chǎn)物來進行樣品檢測。可在PCR體系中加入熒光基團，通過所產(chǎn)生的熒光信號變化來動態(tài)監(jiān)測整個反應過程。qPCR是在食品過敏原檢測中應用最為廣泛的一項基因水平檢測技術。qPCR的特異性和靈敏度均優(yōu)于普通PCR，在進行定性分析的同時，實現(xiàn)了在復雜食品基質(zhì)中對多重過敏原的定量分析。利用PCR檢測大豆過敏原容易出現(xiàn)假陽性或假陰性結果，因此PCR在大豆過敏原檢測中的應用有所局限。

2） LAMP技術

LAMP技術是根據(jù)6～8 種不同的靶基因DNA序列開發(fā)設計出4～6 種特異性引物，60～65℃恒溫下在鏈置換DNA聚合酶作用下進行大量擴增，短時間內(nèi)可實現(xiàn)靶基因的特異性顯著擴增。LAMP的分析檢測結果通過反應體系中樣品顏色等變化進行評估。與傳統(tǒng)的PCR和qPCR檢測方法相比，LAMP具有許多優(yōu)點，如恒溫擴增、反應時間短、檢測結果可通過肉眼判斷等。該方法最主要的難點在于引物的設計，其直接決定了檢測方法的準確性。基于DNA的LAMP-側(cè)向流動免疫法是一種操作簡單的大豆致敏原檢測方法，其顯示出比商業(yè)側(cè)向流動免疫法更高的靈敏度及特異性。

2.3 不同檢測方法的對比

隨著全球范圍內(nèi)食品多樣性的增加，食品中可能含有的過敏原含量及種類不斷上升，檢測難度不斷升高，總結和認識現(xiàn)有檢測方法的優(yōu)勢與不足（表1），對于食品中不同過敏原的快速精準檢測具有重要作用。