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海南大學(xué)于志鵬教授：基于虛擬篩選和分子對(duì)接鑒定雞蛋蛋白源苦味受體T2R14阻滯肽

海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院于志鵬課題組以雞蛋蛋白為原料，結(jié)合虛擬篩選、分子對(duì)接、電子舌體外驗(yàn)證以及分子動(dòng)力學(xué)模擬技術(shù)篩選和鑒定新型苦味受體T2R14阻滯肽，并揭示了苦味物質(zhì)與苦味受體T2R14相互作用的分子機(jī)制。

Introduction

苦味作為五種基本味覺(jué)之一，常給人帶來(lái)不愉悅的感覺(jué)。苦味不僅天然存在于植物中，在食品蛋白質(zhì)酶解、加熱或發(fā)酵過(guò)程中也常伴隨著苦味的產(chǎn)生，因此，苦味受體T2R14阻滯肽的篩選與鑒定對(duì)于食品工業(yè)的發(fā)展將具有重大意義。

苦味受體（T2Rs）屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR），可以介導(dǎo)苦味識(shí)別過(guò)程。T2Rs基因家族含有25 種功能性受體編碼基因，可以識(shí)別多種苦味物質(zhì)，其中，T2R14對(duì)苦味物質(zhì)的調(diào)節(jié)范圍最廣，可以被多種苦味化合物激活。加強(qiáng)對(duì)苦味受體T2R14識(shí)別機(jī)制的研究，可以為苦味受體阻滯肽的篩選和鑒定提供更多的理論依據(jù)。

已有研究從虹鱒魚和蝦夷扇貝中篩選出具有阻滯苦味受體T2R14能力的肽序列。雞蛋中蛋白質(zhì)含量高，是生物活性肽的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。本研究嘗試從雞蛋蛋白中篩選潛在的苦味受體T2R14阻滯肽。然而，傳統(tǒng)的生物活性肽分離、純化方法耗時(shí)長(zhǎng)且成本高。基于計(jì)算機(jī)輔助篩選方法能省時(shí)和節(jié)約成本，可以在一定程度上對(duì)采用傳統(tǒng)方法篩選苦味受體阻滯肽進(jìn)行互補(bǔ)。Peptide Cutter在線酶解程序可用于預(yù)測(cè)某些代表性蛋白質(zhì)釋放的肽序列。目前，分子對(duì)接已被廣泛用于模擬配體和受體之間的相互作用，并已被證明是計(jì)算機(jī)輔助受體-配體結(jié)合預(yù)測(cè)的重要工具。許多研究已經(jīng)證明了虛擬篩選的有效性。

Results and discussion

雞蛋蛋白虛擬酶解與篩選

采用ExPASy Peptide Cutter（http://web.expasy.org/peptide_cutter/）對(duì)雞蛋蛋白進(jìn)行虛擬酶解，... property calculator（http://www.innovagen.com/proteomics-tool）對(duì)得到的肽序列進(jìn)行水溶性、生物活性以及毒性預(yù)測(cè)（見(jiàn)表1），篩選出來(lái)的水溶性好、生物活性好以及無(wú)毒性的肽序列。

表1蛋清蛋白活性肽活性分析

將潛在的活性肽與苦味受體T2R14進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接能量結(jié)果見(jiàn)表2。較高的“-CDOCKER_ENERGY”代表肽與苦味受體T2R14之間的親和力更高。肽CQR、CGSR與苦味受體T2R14的對(duì)接能最高，分別為314.254 8、294.842 7 kJ/mol，已被報(bào)道的苦味受體阻滯肽LEGSLE與苦味受體T2R14對(duì)接值為277.01 kJ/mol，結(jié)果表明篩選出來(lái)的兩個(gè)肽序列CQR和CGSR與苦味受體T2R14受體具有很高的親和力，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。
表2 分子對(duì)接結(jié)果

肽與苦味受體T2R14的相互作用機(jī)制分析
CQR、CGSR與苦味受體T2R14的分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。結(jié)果表明苦味受體T2R14氨基酸殘基Asp168、Ile262、Ser265和Asn157與肽CQR形成氫鍵，同時(shí)Asp168、Ile262、Ser265和Thr182與肽CGSR形成氫鍵。這些氫鍵是肽CQR和CGSR與苦味受體T2R14相互作用的重要作用力。此外，氨基酸殘基Ser265與Asp168一直是肽與T2R14的結(jié)合位點(diǎn)，這表明，苦味受體T2R14氨基酸殘基Ser265和Asp168可能對(duì)苦味產(chǎn)生起到關(guān)鍵作用。
a.肽CQR與T2R14對(duì)接位點(diǎn)圖；b.肽CQR與T2R14相互作用的二維平面圖；c.肽CQR與T2R14相互作用的三維模型。
圖1 肽CQR與苦味受體T2R14分子對(duì)接結(jié)果

a.肽CGSR與苦味受體T2R14對(duì)接位點(diǎn)圖；b.肽CGSR與苦味受體T2R14相互作用的二維平面圖；c.肽CGSR與苦味受體T2R14相互作用的三維模型。
圖2. 肽CGSR與苦味受體T2R14分子對(duì)接結(jié)果
肽CQR、CGSR與苦味受體T2R14的分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果見(jiàn)圖3。圖3a表明，15 ns后RMSD值達(dá)到平衡，在穩(wěn)定狀態(tài)下，CQR-T2R14復(fù)合物和CGSR-T2R14復(fù)合物的RMSD分別在0.38 nm和0.36 nm左右波動(dòng)。復(fù)合物的RMSD漲落值均在合理范圍內(nèi)，說(shuō)明模擬后體系中復(fù)合物的結(jié)構(gòu)處于平衡狀態(tài)；圖3b顯示兩種復(fù)合物的曲線波動(dòng)趨勢(shì)相似，說(shuō)明結(jié)合過(guò)程中氨基酸的波動(dòng)是相似的。在兩條曲線的末端，RMSF值都較高，這可能是由于肽兩端氨基酸的高柔韌性，有利于肽與T2R14的結(jié)合；圖3c顯示CQR-T2R14復(fù)合物和CGSR-T2R14復(fù)合物在40 ns模擬過(guò)程中波動(dòng)較小，波動(dòng)范圍在2.09 ~ 2.21 nm，表明受體與苦味阻斷肽具有較高的親和力。因此，肽CQR、CGSR與苦味受體T2R14結(jié)合后具有較高的穩(wěn)定性。

a. COQ-T2R14和CGSR-T2R14分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中復(fù)均方根偏差（RMSD）隨時(shí)間的變化；b. COQ-T2R14和CGSR-T2R14分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中殘基復(fù)均方根波動(dòng)（RMSF）差異的變化；c. COQ-T2R14和CGSR-T2R14的折疊狀態(tài)和整體構(gòu)象分析。
圖3 COQ-T2R14和CGSR-T2R14分子動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果
Conclusion
從雞蛋蛋白中篩選并鑒定出兩種新的苦味受體T2R14阻滯肽CQR和CGSR。分子對(duì)接結(jié)果表明，Ser265和Asp168可能在肽CQR和CGSR發(fā)揮苦味阻滯過(guò)程中起關(guān)鍵作用，氫鍵是肽和苦味受體相互作用的關(guān)鍵作用力。這項(xiàng)工作為篩選苦味受體T2R14阻滯肽提供了新思路，并且有助于解決食品工業(yè)中的苦味困擾問(wèn)題。
Abstract
Bitter taste receptors (T2Rs) perform crucial role in the sensation of bitterness, especially the T2R14 that can widely perceive the bitterness. In this study, egg protein-derived T2R14 blocking peptides were identified using physicochemical property prediction, molecular docking, molecular dynamic simulation, and in vitro validation. The ‘-CDOCKER_ENERGY’ values of peptides CQR and CGSR were higher than the positive control LEGSLE, were 314.26 and 294.85 kJ/mol, respectively. The results showed that the half inhibitory concentration (IC50) of the egg protein-derived peptides CQR and CGSR were 382.87 and 370.13 μmol/L, respectively, and higher than that of the positive control LEGSLE. The molecular docking results showed that the conventional hydrogen bond interaction was the main binding force between T2R14 and peptides (i.e., CQR and CGSR). In summary, the novel T2R14 blocking peptides CQR and CGSR were identified, and aided in understanding the mechanism responsible for T2R14 blocking peptides. This study provides further guidance to block T2R14 and may address the bitterness problem in the food industry.

專家及作者介紹

于志鵬教授
海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院
于志鵬，男，海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，高聘教授，九三學(xué)社社員，研究生導(dǎo)師，海南自由貿(mào)易港高層次人才，海南省“三區(qū)人才”，中國(guó)畜產(chǎn)品加工研究會(huì)青年工作委員會(huì)委員，中國(guó)蛋品加工業(yè)杰出青年，Food Science of Animal Products編委， Frontiers in Nutrition 專刊客座主編。近5年，主持國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目2項(xiàng)，國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃子課題1項(xiàng)，省重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目等縱向科研項(xiàng)目4項(xiàng)，企業(yè)委托橫向課題4項(xiàng)，獲省自然科學(xué)學(xué)術(shù)成果獎(jiǎng)3項(xiàng)。研究主要集中于ACE抑制肽（降血壓活性肽）、降血糖活性肽、免疫調(diào)節(jié)活性肽和抗老年癡呆活性肽的酶解制備、結(jié)構(gòu)鑒定；基于分子模擬的作用機(jī)制及穩(wěn)態(tài)化保護(hù)機(jī)制研究；基于食品組學(xué)技術(shù)探究活性肽的體內(nèi)作用機(jī)制。近年來(lái)，以第一作者/通信作者發(fā)表活性肽相關(guān)的SCI檢索論文54篇（其中，中科院大類分區(qū)一區(qū)29 篇）；申請(qǐng)有關(guān)活性肽等功能因子的國(guó)家發(fā)明專利51 項(xiàng)，其中以第一發(fā)明人獲得授權(quán)國(guó)家發(fā)明專利19 項(xiàng)，完成成果轉(zhuǎn)化1 項(xiàng)。