綜合蛋白質(zhì)組-轉(zhuǎn)錄組分析揭示副干酪乳桿菌H4-11和馬克斯克魯維酵母L1-1在共培養(yǎng)條件下的生活方式
2023-12-01作者：來源：責任編輯：食品界
字體A+AA-
副干酪乳桿菌（L. paracasei）和馬克斯克魯維酵母（K. marxianus）各自的生物學性質(zhì)已被報道。然而，先前的研究不能提供在米酸中共同接種的兩種菌株的相互作用及協(xié)同發(fā)酵的全面概況，也不能揭示在米酸風味形成和成熟過程中微生物生長和風味代謝調(diào)節(jié)之間的關系。因此，可通過轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合蛋白組定量分析來解釋K. marxianus L1-1和L. paracasei H4-11協(xié)同發(fā)酵米酸的風味形成機理。課題組前期研究分析了L. paracasei H4-11和 K. marxianus L1-1在分子水平和蛋白水平上米酸風味機理，與mRNA相比，蛋白與代謝產(chǎn)物之間具有更直接的關聯(lián)。貴州大學劉娜博士、貴州大學秦禮康教授和愛爾蘭農(nóng)業(yè)部Teagasc國家食品研究中心繆松教授在本研究中將繼續(xù)通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組的聯(lián)合分析，更加充分的解釋米酸風味代謝物形成的原因，揭示L. paracasei H4-11和 K. marxianus L1-1協(xié)同發(fā)酵米酸風味強化機理。 在第3天和第1天分別進行了雙菌發(fā)酵米酸和單菌發(fā)酵米酸的比較轉(zhuǎn)錄組和比較蛋白組分析，發(fā)現(xiàn)與L. paracasei H4-11生長有關的大多數(shù)DEPs定位在細胞質(zhì)、細胞質(zhì)膜和細胞壁中（圖1A和圖1C）。而與K. marxianus L1-1生長有關的大多數(shù)DEPs定位在細胞核、線粒體、細胞質(zhì)和線粒體中（圖1B和圖1D）。表明這兩種細胞具有不同的生活方式，并且對米酸的風味形成表現(xiàn)出不同的影響。
圖1 雙菌接種發(fā)酵米酸對比單菌接種發(fā)酵米酸第1和第3天時L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1差異表達蛋白質(zhì)的亞細胞結構分布圖 在K. marxianus L1-1存在時，L. paracasei H4-11中的上/下調(diào)DEPs富集表達在翻譯、核糖體結構、與儲存和加工聯(lián)系的生物進程、與細胞過程和信號有關的細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生、能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化、碳水化合物轉(zhuǎn)運和代謝、氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝、核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝、無機離子轉(zhuǎn)運和代謝、輔酶轉(zhuǎn)運和代謝以及脂質(zhì)與新陳代謝有關的運輸和代謝通路中（圖2A-B）。在L. paracasei H4-11存在時，K. marxianus L1-1中的DEPs在以上代謝途徑中也富集表達（圖S2C-D）。但兩種培養(yǎng)物中DEPs表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05）。蛋白組分析表明下調(diào)的蛋白可能與雙菌發(fā)酵米酸對比單菌發(fā)酵米酸中不良風味特征相關的滋味物質(zhì)（如苦味和澀味）信號強度的減少有關。綜上，可進一步揭示這兩種菌在發(fā)酵米酸中存在相互或協(xié)同作用。
圖2 雙菌接種發(fā)酵米酸對比單菌接種發(fā)酵米酸第1和第3天時， L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1差異表達蛋白的COG/KOG功能分類分布圖 如圖3，在雙菌發(fā)酵米酸體系對比單菌發(fā)酵，L. paracasei H4-11在糖酵解過程中利用上調(diào)的磷酸葡萄糖突變酶（LSEI_0949）分解α-D-1磷酸葡萄糖為α-D-6磷酸葡萄糖，之后K. marxianus L1-1中的己糖激酶（KLMA_10051）發(fā)生下調(diào)使得生成的α-D-葡萄糖量減少，L. paracasei H4-11中的醛糖1-表異構酶下調(diào)，這反過來導致K. marxianus L1-1中的己糖激酶下調(diào)，底物減少后進而使得K. marxianus L1-1中的磷酸丙糖異構酶（KLMA_40125）、甘油醛3-磷酸脫氫酶、二磷酸甘油酯依賴性磷酸甘油酯變位酶以此呈下調(diào)變化，而上調(diào)的磷酸葡萄糖突變酶分解底物轉(zhuǎn)化成更多的丙酮酸，使得L-乳酸脫氫酶活性（LSEI_0634）增強，從而形成更多的L-乳酸。同時，L. paracasei H4-11中的L-乳酸脫氫酶活性上調(diào)、D-乳酸脫氫酶活性下調(diào)，它們共同作用生成更多的L-乳酸。在丙酮酸代謝中，K. marxianus L1-1中的乙醇脫氫酶（KLMA_40220）分別表現(xiàn)出上調(diào)和下調(diào)變化，過多的丙酮酸被L. paracasei H4-11進一步分解，乙醇脫氫酶（LSEI_0775）活性表達為上調(diào)。而K. marxianus L1-1中上調(diào)的乙醇脫氫酶進一步使得乙醛脫氫酶（KLMA_40404）上調(diào)，乙醛脫氫酶可負責催化乙醛氧化為乙酸，促使乙酸含量增加。進而，L. paracasei H4-11在TCA循環(huán)中分解底物使得乙酸激酶的活性增強，進而生成更多的乙酸。而K. marxianus L1-1和L. paracasei H4-11中乙醇脫氫酶的共同上調(diào)促使更多的乙酸生成。導致K. marxianus L1-1中乙酰輔酶A、酰基輔酶A和N-乙酰轉(zhuǎn)移酶表現(xiàn)為上調(diào)變化，而乙醇O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶呈下調(diào)。同時發(fā)現(xiàn)L. paracasei H4-11中乙酰輔酶A和N-乙酰轉(zhuǎn)移酶呈上調(diào)和下調(diào)變化，這些酶促使乙醇和乙酸形成更多的乙酸乙酯。綜上，在雙菌培養(yǎng)體系中L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1協(xié)同作用促進了L-乳酸和乙酸乙酯的形成。 
圖3 雙菌發(fā)酵米酸中L. paracasei H4-11和K. marxianus L1-1協(xié)同作用形成L-乳酸和乙酸乙酯機理 在米酸發(fā)酵第1天時，雙菌發(fā)酵米酸對比單菌發(fā)酵米酸可知，L. paracasei H4-11中存在6個關鍵的上調(diào)基因及5個關鍵的上調(diào)蛋白和13個關鍵的下調(diào)蛋白質(zhì)富集表達在丙氨酸、天門冬氨酸和谷氨酸代謝、精氨酸生物合成、氮代謝、果糖和甘露糖代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、丙酮酸代謝和硫代謝KEGG通路中（表1）。此時，K. marxianus L1-1中存在6個關鍵的上調(diào)基因及13個關鍵的上調(diào)蛋白和15個關鍵的下調(diào)蛋白富集表達在丙酮酸代謝、ABC轉(zhuǎn)運器、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、D-精氨酸和D-鳥氨酸代謝、果糖和甘露糖代謝、淀粉和蔗糖代謝等KEGG通路中（表2）。 表1 L. paracasei H4-11在第1天的差異表達基因/蛋白
表2 K. marxianus L1-1在第1天的差異表達基因/蛋白
在米酸發(fā)酵第3天時，雙菌發(fā)酵米酸對比單菌發(fā)酵米酸可知，L. paracasei H4-11中存在2個關鍵上調(diào)基因及7關鍵下調(diào)基因，同時存在10個關鍵上調(diào)蛋白和8個關鍵下調(diào)蛋白富集表達在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、氮代謝、氨基糖和核苷酸糖代謝、萘降解/氯烷和氯烯烴降解、ABC轉(zhuǎn)運器、蛋白質(zhì)輸出等KEGG通路中（表3）。此時，K. marxianus L1-1中存在7個關鍵上調(diào)基因和2個關鍵下調(diào)基因和6個關鍵上調(diào)蛋白及23個關鍵下調(diào)蛋白富集表達在精氨酸生物合成、氮代謝、淀粉和蔗糖代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、氨酰基-tRNA的生物合成、半乳糖代謝、果糖和甘露糖代謝KEGG通路中（表4）。 表3 L. paracasei H4-11在第3天的差異表達基因/蛋白
表4 K. marxianus L1-1在第3天的差異表達基因/蛋白
劉娜，貴州大學與愛爾蘭農(nóng)業(yè)部Teagasc國家食品研究中心聯(lián)合培養(yǎng)博士，以第一作者身份發(fā)表SCI文章10篇，主要研究方向為食品微生物及發(fā)酵食品風味調(diào)控機理。 
秦禮康，貴州大學釀酒與食品工程學院副院長、教授、博士、博士生導師、學術學科帶頭人，兼任教育部食品科學與工程類專業(yè)教指委委員、省食安委委員、省法院知識產(chǎn)權審判咨詢專家等。主要從事特色油料高品質(zhì)制油及新產(chǎn)品延伸技術、優(yōu)勢雜糧雜豆主食化及高值化精深加工技術、特色發(fā)酵食品品質(zhì)提升及新產(chǎn)品開發(fā)技術、營養(yǎng)健康全谷物主食化新產(chǎn)品加工及保質(zhì)技術、食品安全控制及風險評估等科研工作。先后主持國家、省、市各類課題及企業(yè)橫向項目30多項，經(jīng)費1000多萬元，發(fā)表學術論文50多篇(其中SCI收錄20篇)，授權國家發(fā)明專利10件。 
繆松，教授，現(xiàn)為愛爾蘭農(nóng)業(yè)與食品發(fā)展部Teagasc國家食品研究中心終身高級研究員、愛爾蘭國立科克大學（UCC）和都柏林大學（UCD）博士生導師，長期從事食品材料及貯藏加工技術領域基礎理論和應用研究，曾在愛爾蘭國家生物技術中心從事博士后研究，在荷蘭聯(lián)合利華研發(fā)中心任全球研發(fā)經(jīng)理及研發(fā)專員。繆松博士自任職Teagasc國家食品研究中心以來，長期與國內(nèi)多所高校及科研院所、跨國企業(yè)保持密切合作關系，主要研究方向為：食品物性材料學，食品干燥與造粒，粉末技術，益生菌和活性分子包埋，食品結構及傳遞體系設計，食品加工與功能性, 乳品技術以及植物基功能食品配料等。
Integrative proteomic-transcriptomic analysis revealed the lifestyles of Lactobacillus paracasei H4-11 and Kluyveromyces marxianus L1-1 under co-cultivation conditions
Na Liua,b,c, Likang Qina,*, Haiying Zenga, Anyan Wena, Song Miaoc,*
a School of Liquor and Food Engineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
b Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education), Collaborative Innovation Center for Mountain Ecology & Agro-Bioengineering (CICMEAB), College of Life Sciences/Institute of Agro-bioengineering, Guizhou University, Guiyang 550025, China
c Teagasc Food Research Centre, Moorepark, Fermoy, P61 C996 Co. Cork, Ireland
*Corresponding authors.
Abstract
Compared with the rice-acid soup inoculated with single starter, the synergistically intensified rice-acid soup inoculated with Lactobacillus paracasei H4-11 (L. paracasei H4-11) and Kluyveromyces marxianus L1-1 (K. marxianus L1-1) contained more flavor compounds. Organic acids mainly included L-lactic acid and the main volatile flavor component was ethyl acetate. Moreover, the signal intensity of astringency and bitterness and the total concentration of volatile sulfur compounds were reduced. The combined analysis results of RNA sequencing (RNA-seq) technology and 4D label-free quantitative (4D LFQ) proteomics explained the flavor formation pathways in rice-acid soup inoculated with L. paracasei H4-11 and K. marxianus L1-1. In L. paracasei H4-11, L-lactate dehydrogenase, phosphoglucomutase, acetate kinase, alcohol dehydrogenase and acetyl-CoA were up-regulated and D-lactate dehydrogenase and N-Acetyltransferase were down-regulated. In K. marxianus L1-1, Acetyl-CoA, acetaldehyde dehydrogenase, acyl-coenzyme A, N-acetyltransferase, and L-lactate dehydrogenase were up-regulated and hexokinase, alcohol dehydrogenase, and alcohol O-acetyltransferase were down-regulated. The above up-regulation and down-regulation synergistically promoted the formation of characteristic flavor compounds (mainly L-lactic acid and ethyl acetate). Enzyme-linked immunoassay (ELISA) and parallel reaction monitoring (PRM) quantitative analysis respectively verified that 5 key metabolic enzymes and 27 proteins in L. paracasei H4-11 and K. marxianus L1-1 were associated with the characteristic flavor of rice-acid soup, as confirmed by the quantitative results of 4D LFQ.
LIU N, QIN L K, ZENG H Y, et al. Integrative proteomic-transcriptomic analysis revealed the lifestyles of Lactobacillus paracasei H4-11 and Kluyveromyces marxianus L1-1 under co-cultivation conditions[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(6): 2195-2210. DOI:10.1016/j.fshw.2023.03.032.
