近年來肥胖癥患者數(shù)量明顯上升，造成肥胖的原因是體內(nèi)脂肪過多堆積、脂質(zhì)代謝異常。胰脂肪酶是人類脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵酶，可作為抗肥胖藥物的特定靶點(diǎn)。食品來源的胰脂肪酶抑制劑，如多酚、多糖、多肽等不僅有效抑制胰脂肪酶的活性，而且安全性更高，是目前食品工業(yè)的研究熱點(diǎn)。目前有報(bào)道沙棘籽粕蛋白可以有效降低糖尿病小鼠的體質(zhì)量和體內(nèi)甘油三酯的含量。活性肽是一類具有特殊生理功能的蛋白質(zhì)片段，受到外界影響時(shí)，內(nèi)部結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致其性質(zhì)發(fā)生改變。

在前期研究的基礎(chǔ)上，中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所的相歡和華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院的崔春*首先探究了溫度、pH值、金屬離子、光照及氧氣對(duì)沙棘籽粕蛋白胰脂肪酶肽抑制活性的影響。在此基礎(chǔ)上，為獲得具有更高活性的沙棘籽粕蛋白肽（SSPA），以豬胰脂肪酶（PPL）抑制率為指標(biāo)，將沙棘籽粕蛋白酶解液依次通過超濾、大孔樹脂進(jìn)行分離，篩選出具有較強(qiáng)活性的多肽，利用分子對(duì)接分析活性肽與PPL之間的作用，化學(xué)合成活性肽對(duì)其活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)沙棘籽粕胰脂肪酶抑制肽提供理論基礎(chǔ)。

而對(duì)于其他因素如光照和氧氣對(duì)SSPA活性的影響如圖1D所示，在日光燈和紫外燈照射條件下，SSPA的PPL抑制率無顯著變化（P＞0.05），表明該產(chǎn)品在實(shí)際生產(chǎn)中可采用紫外滅菌。SSPA的PPL抑制活性在有氧和無氧條件下無顯著差異，說明SSPA在短期貯藏的過程中不會(huì)因暴露于空氣而影響其生物活性。

如表2所示，SSPA及其超濾組分對(duì)PPL的IC₅₀值不同，其中SSPA的IC₅₀值最高（1 198 μg/mL），而經(jīng)過超濾后其抑制效果明顯增強(qiáng)，并且隨著分子質(zhì)量的降低呈現(xiàn)抑制增強(qiáng)的趨勢(shì)，其中分子質(zhì)量小于3 kDa的組分IC₅₀為309.8 μg/mL，收集該組分并進(jìn)行后續(xù)的分離鑒定。

如圖2D所示，HPD826在0～4 min內(nèi)快速擴(kuò)散，之后從4～150 min緩慢吸附，最終在150～240 min內(nèi)吸附飽和呈現(xiàn)平衡狀態(tài)；其余3 種樹脂同樣保持3 個(gè)階段的吸附，第1階段為表面吸附（0～5 min），第2階段為快速吸附擴(kuò)散階段（5～180 min），最后階段為吸附緩慢最終飽和（180～240 min）。說明4 種樹脂對(duì)SSPAL的吸附不同，且表現(xiàn)多重性質(zhì)。

HPD826樹脂在整個(gè)吸附過程中效果最佳。HPD826樹脂具有相對(duì)理想的表面積（500～600 cm²），并且可以通過氫鍵與SSPAL中的側(cè)鏈氨基酸相互作用，從而發(fā)揮更好的吸附和解吸能力。如表3所示，經(jīng)HPD826大孔樹脂分離之后，SSPAL的胰脂肪酶抑制率顯著提高，IC₅₀顯著降低。

03 UPLC-MS/MS鑒定SSPA

利用UPLC-MS/MS對(duì)SSPAL-E組分進(jìn)行檢測(cè)。如表4所示，一級(jí)質(zhì)譜圖中得到多個(gè)母離子，進(jìn)行分析后得到二級(jí)離子碎片的信息。SSPA中鑒定得到31 種多肽，其中含有2 個(gè)氨基酸的肽段有11 個(gè)，約占35.48%；含有3 個(gè)氨基酸的肽段有15 個(gè)。鑒定得到較多含精氨酸的多肽（19 個(gè)）。以Hippophae rhamnoides為關(guān)鍵詞，在UniProt中進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)肽段來源于Protein TIC214，包括NN、VR、LR/IR、DR、TR、FD、EF、FR、PSP、ELR/EIR、EER和NLLHR。另外還有部分肽段來源于Protein Ycf2，包括EDS、QLF、FL(I)R和WRN。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)（峰面積）計(jì)算得到分離組分中多肽總量為28.08%，其中VR、FR、RDR、APYR、NLLHR和EEAASLR的肽含量較高，分別為2.90%、7.40%、1.10%、1.50%、1.40%和1.10%。VR、FR和NLLHR均源于Protein TIC 214，RDR來源于Ribulose bisphosphatecarboxylase large chain，APYR來源于30S ribosomalprotein S2, chloroplastic，EEAASLR來源于PhotosystemI P700 chlorophylla apoprotein A2。使用Peptide Ranker可計(jì)算出多肽的生物活性潛力，SSPA的理論得分范圍為0.036 7～0.997 1，說明其生物活性存在較大差異。據(jù)報(bào)道，預(yù)測(cè)得分超過0.5的多肽被認(rèn)為具有較強(qiáng)的生理活性，表4中有20 個(gè)多肽得分大于0.5，可認(rèn)為具有較高生物活性，根據(jù)ToxinPred分析，這20 種多肽均沒有毒性，將對(duì)其進(jìn)行后續(xù)分析。

04 SSPA的活性分析

4.1 分子模擬分析SSPA的活性

采用PepSite2對(duì)Peptide Ranker大于0.5的SSPA進(jìn)行初步分析，繼續(xù)篩選出P＜0.05的肽，分別是VR、FR、APYR、EEAASLR、RDR、NLLHR、QLF、ALPMDW、MLA和PSP。

圖3結(jié)合質(zhì)譜圖中強(qiáng)度評(píng)分最終篩選出多肽序列。除PSP和MLA外，其余8 個(gè)肽的強(qiáng)度均高于500，多肽強(qiáng)度變化為：EEAASLR（16 000）＞FR（8 000）＞NLLHR（5 000）＞APYR（2 000）=ALPMDW（2 000）＞RDR（1 600）＞QLF（1 000）＞VR（600）。分子對(duì)接結(jié)合能順序?yàn)椋篍EAASLR=QLF＞FR=RDR＞VR＞APYR＞ALPMDW＞NLLHR，如表5所示，結(jié)合能越小說明抑制能力越強(qiáng)（）。結(jié)合以上分析結(jié)果及多肽含量，選擇VR（2.90%）、FR（7.40%）、RDR（1.10%）、APYR（1.50%）、NLLHR（1.40%）和EEAASLR（1.10%）進(jìn)行合成分析。

4.2 SSPA與PPL結(jié)合位點(diǎn)分析

分子對(duì)接結(jié)果表明多肽與PPL之間至少有一種相互作用，這些相互作用（親水作用、氫鍵、疏水作用、π-π相互作用/堆疊作用和范德華力）可以穩(wěn)定肽-PPL復(fù)合物，并影響或改變PPL構(gòu)象（圖4）。氫鍵是抑制PPL的主要因素，以上肽段均提供了Arg（R）殘基，精氨酸包含一個(gè)α-氨基、α-羧基和一個(gè)側(cè)鏈胍基，因此能夠通過氫鍵與帶電殘基相互作用，并通過其亞甲基與疏水殘基相互作用。VR通過離子鍵（Asp 80）、氫鍵（Ser 153、Phe 78）、π-π共軛（Phe 216、Tyr 115）和疏水相互作用（Phe 216、Tyr 115）與PPL結(jié)合。FR主要通過氫鍵和π-π堆疊與PPL結(jié)合，其中氫鍵作用主要表現(xiàn)為NH：Phe 78（2.58 ?）、Arg 257（2.42 ?）；OH：Gly 77（3.03 ?）、His 152（2.62 ?）。π-π堆疊主要表現(xiàn)為Phe的苯環(huán)與PPL中的Tyr 115、Phe 216和Pro 181殘基的相互作用。RDR主要通過氫鍵與PPL結(jié)合，PPL中的His 152、Gly 77和Arg 257與RDR中的氧原子結(jié)合，形成OH鍵。另外PPL中的Phe 78和His 264通過CH鍵與RDR結(jié)合。PPL中的Phe 78與APYR中的R基團(tuán)上的N原子形成氫鍵，而APYR中的Tyr上的苯環(huán)與PPL中Phe 216和Phe 78中的苯環(huán)形成π-π相互作用。NLLHR與PPL的結(jié)合位點(diǎn)較多，主要表現(xiàn)為與PPL上的Phe 78（2.58 ?）、Arg 257（2.42 ?）、His 152（2.62 ?）形成氫鍵，此外NLLHR與PPL上的ALA 179、Pro 181、Phe 216 和Ile 79通過烷基或π-烷基作用結(jié)合。EEAASLR與PPL中的Arg 257和Phe 78形成氫鍵，與Phe216形成π-π相互作用。