消費者對健康和生活質(zhì)量的日益關(guān)注，增加了對具有功能特性和對人體健康有積極影響的天然產(chǎn)品的需求。開發(fā)含有天然成分的新食品已成為促進(jìn)健康的飲食策略。羊奶經(jīng)過不同的工藝處理，制成了多種品質(zhì)優(yōu)良、接受度高的發(fā)酵乳制品。羊奶和牛奶在蛋白質(zhì)、脂肪和乳糖含量方面有相似之處；然而，一些差異(例如氨基酸組成、酪蛋白膠束的物理化學(xué)性質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)之間的聚集以及較小的脂肪球和脂肪酸鏈長度)賦予了羊奶低過敏性和高消化率，這些特性越來越受到消費者的興趣。

飲食對腸道菌群的組成和代謝活性有很大影響，被認(rèn)為是與腸道菌群多樣性改變相關(guān)的慢性疾病發(fā)生的重要影響因素。腸道菌群調(diào)節(jié)的重要性日益增加，促使人們尋找能夠積極影響腸道菌群的化合物，從而有益于宿主健康。

與膳食纖維類似，酚類化合物被認(rèn)為能夠為腸道微生物群提供益處。大多數(shù)膳食中的酚類化合物在小腸中不被吸收，而是到達(dá)結(jié)腸，并在結(jié)腸微生物群中進(jìn)行強(qiáng)烈的生物轉(zhuǎn)化。除了增加種群數(shù)量和刺激形成腸道微生物群的有益群的代謝活性外，這種轉(zhuǎn)化應(yīng)該產(chǎn)生更活躍和生物可利用的酚類化合物形式。

伊莎貝爾葡萄(Vitis labrusca L.)是巴西種植最多的葡萄品種之一，主要用于自然消費和果汁生產(chǎn)。伊莎貝爾葡萄精心制作的低熱量制劑和從衍生固體副產(chǎn)品(種子和果皮)中獲得的面粉的整體使用，使得產(chǎn)品具有高含量的纖維和具有抗氧化活性的花青素，除了與水果農(nóng)工部門采用的新興零殘留物策略相關(guān)的方法。

將這些來自伊莎貝爾葡萄整體價值的成分摻入山羊酸奶應(yīng)該是一種增加產(chǎn)品價值和增加消費者酚類化合物攝入量的策略。研究發(fā)現(xiàn)葡萄纖維和酚類化合物對益生菌以及人體腸道菌群的組成和代謝活性有積極作用。然而，衡量山羊乳制品中富含酚類成分對益生菌和人類腸道微生物群影響的研究仍然有限。

本研究推測，在體外結(jié)腸發(fā)酵過程中，由富含酚類和纖維的伊莎貝爾葡萄成分配制的山羊酸奶可以對益生菌產(chǎn)生刺激作用，并引起人體腸道微生物群的變化。為此，在以伊莎貝爾葡萄低熱量制劑和其固體副產(chǎn)品制成的面粉配制的山羊酸奶培養(yǎng)基中，不同益生菌的活菌計數(shù)和代謝活性，以及體外結(jié)腸發(fā)酵過程中人類腸道微生物群的細(xì)菌數(shù)量和代謝活性的變化。

益生菌嗜酸乳桿菌La-05、干酪乳桿菌LAFTIL-26和乳酸乳桿菌Bb-12在消化山羊酸奶配方(YC、YP和YPF)、葡萄糖和FOS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h的活菌計數(shù)如圖1所示。在含有YC、YP、YPF、葡萄糖和FOS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，所有益生菌的活菌數(shù)均>8(lg (CFU/mL))，培養(yǎng)48 h后，除嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌在含有FOS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)外，其余益生菌的活菌數(shù)均下降。但培養(yǎng)48 h后，所有益生菌的活菌數(shù)均>7(lg (CFU/mL))。與這些結(jié)果一致的是，一項早期研究報道，乳桿菌種類通常在培養(yǎng)約24小時后達(dá)到最大生長。也有報道稱，B. lactis通常在培養(yǎng)8~16 h時達(dá)到最大生長，并且在培養(yǎng)48 h時生長可以保持不變。然而，在本研究中，乳芽孢桿菌Bb-12在培養(yǎng)約12小時時顯示出最高的活菌數(shù)，隨后在培養(yǎng)48小時后活菌數(shù)減少，特別是在含有山羊酸奶樣品的培養(yǎng)基中。這些結(jié)果之間的差異可能與本研究中使用的菌株(即B. lactis Bb-12)的特定代謝特性有關(guān)，隨著時間的推移，影響了其利用培養(yǎng)基中所檢測的山羊酸奶配方中可用營養(yǎng)素的能力。

在培養(yǎng)48 h結(jié)束時，與YC、YP和YPF培養(yǎng)基相比，F(xiàn)OS和葡萄糖培養(yǎng)基中所檢測的益生菌活菌數(shù)更高。與零小時相比，檢測的益生菌在FOS和葡萄糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時后的活菌計數(shù)增加了2.0~2.5(lg (CFU/mL))。這種行為可能與益生菌偏好使用葡萄糖作為主要碳源有關(guān)。然而，YC、YP和YPF在培養(yǎng)48 h后也使所檢測的益生菌活菌數(shù)增加(1~2 (lg (CFU/mL))，增強(qiáng)了它們刺激這些微生物生長的能力。碳水化合物，如在YC、YP和YFP中發(fā)現(xiàn)的乳糖，以及在YP和YPF中發(fā)現(xiàn)的果糖和纖維，也可以作為可發(fā)酵底物來促進(jìn)所研究的益生菌的生長。

圖1 嗜酸乳桿菌La-05 (A)、干酪乳桿菌L-26 (B)和動物乳桿菌亞群活細(xì)胞計數(shù)b-12 (C)，培養(yǎng)48 h

山羊酸奶配方對益生菌代謝活性的影響

無論接種何種益生菌，在整個培養(yǎng)期間，不同單一碳源培養(yǎng)基的pH值均呈下降趨勢(P < 0.05)(表1)，這表明這些培養(yǎng)基中益生菌代謝活性很強(qiáng)。無論接種何種益生菌，在含有FOS和葡萄糖的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)48 h的pH值最低。對于山羊酸奶配方的培養(yǎng)基，總體而言，YP和YPF培養(yǎng)基的pH值最低，其次是YC培養(yǎng)基。

無論添加碳源和接種何種益生菌，培養(yǎng)基中乳酸和乙酸的含量在培養(yǎng)48 h期間均有所增加(表1)。與其他測定的有機(jī)酸相比，乳酸是不同培養(yǎng)中含量最高的有機(jī)酸。培養(yǎng)48 h后乳酸含量最高的培養(yǎng)基是分別接種嗜酸乳桿菌和乳酸芽孢桿菌的葡萄糖培養(yǎng)基(P < 0.05)，這可能與這些培養(yǎng)基的pH值較低有關(guān)。

乙酸含量總體上以接種乳酸菌的YC、YP和YPF培養(yǎng)基最高(P < 0.05)。嗜酸乳桿菌接種的YC、YPF和葡萄糖培養(yǎng)基的乙酸含量均高于FOS培養(yǎng)基(P < 0.05)。培養(yǎng)48 h時，接種干酪乳桿菌的YC、YP和YPF培養(yǎng)基的乙酸含量均高于葡萄糖培養(yǎng)基(P < 0.05)，低于FOS培養(yǎng)基(P≥0.05)。乳酸和乙酸被乳酸菌和雙歧桿菌視為葡萄糖和果糖代謝的主要最終產(chǎn)物，其含量的增加應(yīng)與培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種的益生菌代謝強(qiáng)相關(guān)。

總體而言，接種嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌和乳酸乳桿菌的山羊酸奶培養(yǎng)基檸檬酸初始含量較高(P < 0.05)。在不同培養(yǎng)基中，無論添加碳源還是接種益生菌，培養(yǎng)48 h后檸檬酸含量均下降。在含有FOS或葡萄糖的培養(yǎng)基中未發(fā)現(xiàn)琥珀酸。在不同山羊酸奶配方培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，檸檬酸含量發(fā)生變化。然而，無論接種何種益生菌，在YPF培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h時，琥珀酸含量均下降(P< 0.05)。檸檬酸和琥珀酸天然存在于葡萄及其衍生產(chǎn)品中，但乳酸菌在不同發(fā)酵條件下也可產(chǎn)生檸檬酸和琥珀酸。

pH值的降低和有機(jī)酸含量的增加是與培養(yǎng)基中接種的益生菌代謝有關(guān)的參數(shù)。培養(yǎng)基中pH值和有機(jī)酸含量與YC、YP和YPF的關(guān)聯(lián)，以及接種的益生菌活菌數(shù)的增加，強(qiáng)化了山羊酸奶配方對這些微生物的生長刺激作用。被測益生菌降低培養(yǎng)基pH值和產(chǎn)生有機(jī)酸能力的差異可能與被測物種或菌株的不同代謝特性有關(guān)，這些特性影響了它們利用培養(yǎng)基中可用的營養(yǎng)物質(zhì)增加種群和產(chǎn)生不同代謝物的能力。

表1 不同培養(yǎng)基在48 h內(nèi)的pH值和有機(jī)酸含量

山羊酸奶配方對結(jié)腸菌群目標(biāo)菌群的影響

通過對人體腸道微生物群主要類群的調(diào)查，評價發(fā)酵過程中樣品對微生物群生長和代謝活性的影響。real-time PCR評估的糞便微生物群組成及平均拷貝數(shù)見表2在評估的組中有厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門，它們是人類腸道中4個優(yōu)勢門中的3個，所獲得的結(jié)果與健康人類志愿者糞便中的結(jié)果一致，例如乳酸菌，通常在正常腸道微生物群中發(fā)現(xiàn)的數(shù)量較少，如前所述。

表2 志愿者的糞便微生物群組成

在含有YC、YP、YPF和FOS的培養(yǎng)基中，經(jīng)過8、12和24 h的結(jié)腸發(fā)酵后，檢測(目標(biāo))菌群與陰性對照的相對差異結(jié)果見圖2，統(tǒng)計結(jié)果見表3陰性對照相比，山羊酸奶制劑在24 h的結(jié)腸發(fā)酵過程中顯著增加了乳酸菌的數(shù)量(P < 0.05)。另一方面，與陰性對照相比，F(xiàn)OS在結(jié)腸發(fā)酵8和12 h后未引起乳桿菌種群數(shù)量的增加(P≥0.05)，在結(jié)腸發(fā)酵24 h后僅略有增加。發(fā)酵8、12和24 h后，YC、YP和YPF組乳酸桿菌的數(shù)量增幅(137%~182%)均高于FOS組(0~26%)，尤以YP組為顯著(142%~182%)。發(fā)酵24 h后，YC、YP、YPF和FOS使雙歧桿菌種群數(shù)量較陰性對照增加15%~25%。

圖2 在添加FOS、YP、YPF和YC的培養(yǎng)基中，不同腸道菌群在結(jié)腸發(fā)酵24 h期間與陰性對照的相對差異。(A)乳桿菌，(B)雙歧桿菌，(C)瘦梭菌，(D)厚壁菌門，(E)擬桿菌門

從YC、YP、YPF、FOS和陰性對照培養(yǎng)基中檢測到的細(xì)菌群DNA拷貝值(表3來看，在24 h的結(jié)腸發(fā)酵過程中，山羊酸奶配方和FOS對雙歧桿菌種群的影響相似(P≥0.05)，顯著高于陰性對照(P < 0.05)。FOS在大腸發(fā)酵24 h后才引起乳酸桿菌種群數(shù)量的增加(P≥0.05)，而YPF、YP和YC在大腸發(fā)酵8 h后就引起該種群數(shù)量的增加(圖3)。

表3 在24小時的結(jié)腸發(fā)酵過程中，通過實時PCR獲得不同腸道細(xì)菌群體的數(shù)值

圖3 在含有FOS、YP、YPF、YC和C?的培養(yǎng)基中，腸道微生物群不同菌群的實時PCR DNA拷貝數(shù)。(A)乳桿菌，(B)厚壁菌門，(C)瘦梭菌，(D)擬桿菌門，(E)雙歧桿菌

這些結(jié)果可能與乳酸菌的特點有關(guān)，即與雙歧桿菌相比，乳酸菌對發(fā)酵底物的限制更大，而且對山羊酸奶配方中可用的某些特定營養(yǎng)物質(zhì)(如氨基酸和肽)的要求更高。酸奶具有典型的優(yōu)良蛋白質(zhì)組成，這可能是YPF、YP和YC對乳桿菌種群產(chǎn)生顯著積極作用的原因。蛋白質(zhì)和碳水化合物的結(jié)合可能有助于腸道健康，因為膳食蛋白質(zhì)中的氮對碳水化合物代謝和腸道微生物群生長至關(guān)重要在YP和YPF中分別發(fā)現(xiàn)的酚類化合物(2.99和4.37 mg/100 g)和纖維(25.07和76.70 mg/100 g)(表1)可能是這些酸奶配方發(fā)酵培養(yǎng)基中乳酸桿菌和雙歧桿菌數(shù)量增加的原因。酚類化合物和纖維與人體腸道菌群中乳酸桿菌和雙歧桿菌的刺激作用有關(guān)。乳桿菌和雙歧桿菌是對宿主腸道健康有多種益處的菌群。形成人體腸道菌群的許多細(xì)菌群，包括雙歧桿菌和乳桿菌，都表現(xiàn)出參與酚類化合物分解代謝的β-葡萄糖苷酶活性。膳食纖維也可以被這些細(xì)菌群代謝，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)并誘導(dǎo)腸道微生物群的正向調(diào)節(jié)。

厚壁菌門包括乳桿菌群和瘦梭菌群。在24 h的結(jié)腸發(fā)酵過程中，YC、YP、YPF和FOS使瘦梭菌的種群數(shù)量較陰性對照略有增加(4%~17%)(圖2和表5)。從DNA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)(表5)來看，陰性對照和添加YC、YP和FOS的培養(yǎng)基中l(wèi)eptum的初始和最終種群數(shù)量沒有差異(P≥0.05)。C. leptum是厚壁菌門的主要菌門，占總腸道菌群的16%~25%，此外還與炎癥性腸病的抑制有關(guān)。

與陰性對照相比，YC、YP、YFP和FOS對厚壁菌群的影響很小(0~12%)(圖2)，在結(jié)腸發(fā)酵的24小時內(nèi)，該群體的影響沒有顯著增加(P≥0.05)(表5)。即使山羊酸奶配方在結(jié)腸發(fā)酵期間對乳酸菌種群有很高的積極影響，這些影響沒有擴(kuò)展到厚壁菌門，可能是因為乳酸桿菌是人類腸道微生物群的少數(shù)群體之一(約占2%)。

在大腸發(fā)酵12 h和/或24 h后，與陰性對照相比，YC、YP、YPF和FOS使擬桿菌門種群數(shù)量略有下降(4%~25%)(圖2)。然而，根據(jù)DNA拷貝數(shù)數(shù)據(jù)(表5)，在大腸發(fā)酵24 h期間，F(xiàn)OS和陰性對照使擬桿菌門種群數(shù)量增加(P< 0.05)，而YC、YP和YPF對該門的初始種群和最終種群數(shù)量無差異(P≥0.05)。這些結(jié)果很重要，因為擬桿菌門是擬桿菌門的主要類群，而該類群中的一些物種與對宿主健康的有害影響有關(guān)，例如增強(qiáng)毒素形成和致病性。眾所周知，葡萄纖維和酚類化合物對腸道微生物群有積極作用。雖然與YP相比，YPF顯示出更高的纖維和酚類化合物值，但兩種配方對結(jié)腸微生物群的影響相似。這些結(jié)果表明，YP和YPF之間纖維和測定的酚類化合物濃度的差異不足以引起測量的細(xì)菌種群的顯著差異。

厚壁菌門和擬桿菌門的DNA拷貝結(jié)果用于測定結(jié)腸發(fā)酵8、12和24小時后的F：B比(圖4)。厚壁菌門和擬桿菌門是數(shù)量最多的門，約占人類結(jié)腸微生物群總數(shù)的90%。維持厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度應(yīng)該比刺激其種群增加更重要。在健康個體中，F(xiàn)：B比值通常接近于1，而急劇上升(如達(dá)到20：1)或下降分別與肥胖和體重減輕有關(guān)。所研究的山羊酸奶配方，特別是YP和YPF，在24 h的結(jié)腸發(fā)酵過程中使F：B比維持在1附近，這可能是重要的結(jié)果，表明這些配方能夠維持厚壁菌門和擬桿菌門的種群，而對F：B比的總體影響很 小。

與陰性對照相比，在24小時的結(jié)腸發(fā)酵過程中，所測細(xì)菌群的數(shù)量差異很好地代表了受食品樣品或成分影響時的結(jié)腸微生物群行為，這表明所檢測的山羊酸奶配方對人類腸道微生物群組成具有總體積極影響。此外，對乳酸桿菌和雙歧桿菌種群的特異性刺激作用表明，所檢測的山羊酸奶配方對人類結(jié)腸微生物群具有選擇性刺激特性，這應(yīng)該是表征益生元效應(yīng)所需的標(biāo)準(zhǔn)之一。

圖4 在含F(xiàn)OS、YP、YPF、YC和C?的培養(yǎng)基中，24 h菌落發(fā)酵F：B比值值評估

山羊酸奶配方對結(jié)腸菌群代謝活性的影響

YC、YP、YPF、FOS和陰性對照培養(yǎng)基在結(jié)腸發(fā)酵8、12和24 h后的pH值、糖和有機(jī)酸含量結(jié)果見表4在所檢測的山羊酸奶配方和FOS培養(yǎng)基中，pH值在24 h的結(jié)腸發(fā)酵過程中呈下降趨勢，而陰性對照沒有變化(P≥0.05)。結(jié)腸中pH值的降低可以被認(rèn)為是細(xì)菌發(fā)酵與SCFAs產(chǎn)生相關(guān)的指示物。這種關(guān)系可以通過在所檢測的山羊酸奶配方和FOS培養(yǎng)基中結(jié)腸發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量的增加來證實。

表4 發(fā)酵過程中pH值、糖和有機(jī)酸含量

YP、YFP和FOS培養(yǎng)基中果糖含量相近(P≥0.05)。添加YC、YP和YPF的培養(yǎng)基中乳糖含量較高，以添加YC的培養(yǎng)基中初始乳糖含量最高(P < 0.05)。這些結(jié)果應(yīng)該是意料之中的，因為YP和YPF中伊莎貝爾葡萄成分的存在應(yīng)該會降低這些酸奶配方中牛奶化合物(如乳糖)的濃度。在山羊酸奶配方的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)葡萄糖，可能是由于乳糖被細(xì)菌分解。在24小時的結(jié)腸發(fā)酵過程中，這些糖幾乎或完全被代謝，證實了它們作為底物被結(jié)腸微生物群利用。陰性對照中未發(fā)現(xiàn)果糖、葡萄糖和乳糖。

乳酸和乙酸在添加山羊酸奶和果寡糖的培養(yǎng)基中含量較高，在添加YP和YPF的培養(yǎng)基中含量基本一致(P≥0.05)。在結(jié)腸發(fā)酵過程中發(fā)現(xiàn)乳酸和乙酸含量增加。乳酸和乙酸是乳桿菌和雙歧桿菌發(fā)酵代謝的重要產(chǎn)物，其含量的增加可能與山羊酸奶配方對這些細(xì)菌群產(chǎn)生的積極影響有關(guān)。乳酸是碳水化合物代謝的中間產(chǎn)物，腸道菌群通常利用乳酸生成其他有機(jī)酸。

由于一種微生物代謝的最終產(chǎn)物可能成為另一種微生物的底物，因此許多微生物之間可以相互作用，相互依賴，這是一種交叉攝食代謝。有些有機(jī)酸是發(fā)酵過程的中間產(chǎn)物，如乳酸和琥珀酸，很容易用于交叉飼養(yǎng)過程。乳酸可用于硫酸鹽還原菌合成乙酸。琥珀酸可用于合成丙酸，主要由擬桿菌門和厚壁菌門組成。丁酸可以用乙酸合成，在較低程度上，一些梭狀芽孢桿菌在低葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中也可以用乳酸合成。

大腸發(fā)酵培養(yǎng)基中琥珀酸、丙酸和丁酸含量較低，僅在發(fā)酵8或12 h時發(fā)現(xiàn)。這可能是因為琥珀酸、丙酸和丁酸可以通過以乙酸和乳酸為前體的代謝途徑形成。乙酸、丁酸和丙酸均為短鏈脂肪酸，可被上皮細(xì)胞吸收并被宿主代謝，因其與提供健康益處的機(jī)制相關(guān)而得到認(rèn)可。丁酸和丙酸與腸道生理和免疫功能的調(diào)節(jié)有關(guān)，而乙酸在脂肪生成和糖異生中作為底物。陰性對照的有機(jī)酸只有乙酸、丙酸和丁酸，但與其他發(fā)酵培養(yǎng)基相比含量較低(P < 0.05)。短鏈脂肪酸的產(chǎn)生與底物發(fā)酵的程度直接相關(guān)。結(jié)腸中SCFAs的存在與有益的健康效應(yīng)有關(guān)，如改善免疫和抗炎反應(yīng)，增加營養(yǎng)物質(zhì)的生物利用度和抑制腸道病原體。

本研究的主要局限性可能是山羊酸奶樣品的特性，因為難以接近模擬人類胃腸道消化過程中非常復(fù)雜的物理化學(xué)和生理事件;與主要由兼性厭氧細(xì)菌形成的粘膜表面微生物群相比，使用FI可能更能代表人類結(jié)腸腔中大多數(shù)嚴(yán)格厭氧細(xì)菌的微生物群;以及缺乏對作為腸道菌群一部分的其他微生物群(如瘤胃球菌)的測量。然而，本研究中使用的實驗方案在評估不同食物或衍生物質(zhì)對腸道微生物群的影響的早期調(diào)查中顯示出一致的結(jié)果。