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FSHW | 一種適冷動性球菌來源的絲氨酸蛋白酶的系統(tǒng)功能分析及應用前景

Introduction

蛋白酶是一種重要的水解酶，在洗滌劑、食品、紡織、制藥、多肽合成等工業(yè)領域占據(jù)著舉足輕重的地位，占據(jù)了世界各地市銷酶總量的近60%的市場份額。冷活性蛋白酶一般來源于嗜冷菌，具有低溫催化效率高、結(jié)構(gòu)靈活等優(yōu)勢。目前發(fā)現(xiàn)，冷活性蛋白酶的應用非常廣泛，包括用于冷洗工業(yè)的洗滌添加劑、肉類嫩化和其他食品工業(yè)的加工，在這些應用中，該酶表現(xiàn)出極大的節(jié)能特性，并具有改善冷藏肉類的口感和風味的特性。

魚類因其豐富的蛋白質(zhì)、必需氨基酸和多不飽和脂肪酸等對人體健康有益的營養(yǎng)成分而受到消費者的青睞，成為日常飲食的一部分。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖和漁業(yè)鏈條的不斷發(fā)展，魚類產(chǎn)品的年產(chǎn)量有了顯著的增長，但同時也產(chǎn)生了許多副產(chǎn)品，未得到充分利用或被丟棄。這些副產(chǎn)品可能被用作生產(chǎn)附加值產(chǎn)品的來源，如蛋白質(zhì)水解物和生物活性肽。

因此，江蘇大學-食品與生物工程學院-水產(chǎn)科學與健康課題團隊高瑞昌教授等在本研究中，旨在研究蛋白酶PmSpr288水解鰱魚肉蛋白的性能，并評價其酶解產(chǎn)物的生物活性功能，以期為蛋白質(zhì)水解工業(yè)領域提供一種潛在的性能良好的低溫生物催化劑。

圖1 研究設計

Results and Discussion

序列分析及同源建模

利用NCBI ORF查找工具對編碼PmSpr288的基因進行ORF檢測，發(fā)現(xiàn)該基因長990 bp，編碼一個多肽，推斷分子量為35.3 kDa。利用S8家族的肽酶構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2a）顯示PmSpr288與Planococcus屬處于同一簇。值得注意的是，Planococcus絲氨酸肽酶S8（WP 068488733）與PmSpr288的進化關系最為密切。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，PmSpr288的催化中心由氨基酸殘基Asp49、His86和Ser251組成，Ile129、Leu146和Asn168是其他活性位點。綜上所述，生物信息學分析表明PmSpr288是S8超家族中的一個肽酶。

圖2 系統(tǒng)進化樹與同源建模

PmSpr288在鰱魚蛋白水解中應用

水解研究發(fā)現(xiàn)，PmSpr288對肌球蛋白和肌原纖維蛋白具有相當高的蛋白水解活性（圖3）。隨著酶促反應結(jié)束，肌球蛋白重鏈（220.0 kDa）、肌動蛋白（44.3 kDa）和肌球蛋白輕鏈（21.0 kDa）等條帶的強度明顯消失。然而，沒有觀察到低分子量蛋白條帶的積累，這意味著高分子量蛋白被高效降解為富含多肽和氨基酸的水解產(chǎn)物。PmSpr288對魚蛋白的主要成分肌球蛋白和肌原纖維蛋白具有極高的水解能力，為該酶在魚產(chǎn)品加工工業(yè)中的應用提供了進一步的支持，如制備生物活性肽。

圖3 鰱魚肌球蛋白和肌纖維蛋白的水解產(chǎn)物分析

酶與底物的結(jié)合機制分析

從圖4a可以看出，對蛋白酶和肌動蛋白結(jié)合過程有利的氨基酸被標記（Agr215、Asn224、Asp227、Tyr282、Thr289和Asn301；通過氫鍵連接的Tyr143、Glu167、Lys284、Asp286、Gln354和Lys 373）（黃色）在2.07～3.85 ?之間，鹽橋（粉色）在2.1～3.98 ?之間。同樣，PmSpr288與肌球蛋白的分子對接結(jié)果（圖4b）表明，其結(jié)合過程主要是通過氫鍵進行的，氫鍵可以增強PmSpr288-肌球蛋白復合物的穩(wěn)定性，從而促進蛋白酶與蛋白底物的結(jié)合和水解。此外，蛋白酶與蛋白質(zhì)底物之間氫鍵的形成是確定底物中蛋白酶精確切割位點的關鍵步驟，這為闡明蛋白質(zhì)從特定的柔性區(qū)域開始，然后逐漸降解為多肽和氨基酸的蛋白質(zhì)水解過程提供了系統(tǒng)的分析方法。綜上所述，分子對接結(jié)果表明，結(jié)合區(qū)這些關鍵氨基酸殘基形成的氫鍵是促進酶-底物復合物結(jié)合的主要力量，有助于PmSpr288對蛋白質(zhì)的水解過程。

圖4 酶與底物蛋白酶的分子對接

水解條件優(yōu)化及產(chǎn)物分析

水解條件經(jīng)響應面優(yōu)化后，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中多肽的分子量分布見表1。蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物中低分子量（＜1000 Da）肽的含量為99.44%。其中，180～500 Da占10.06%，180 Da以下占89.38%。上述結(jié)果表明，PmSpr288能夠水解鰱魚肌肉蛋白并產(chǎn)生多種多肽，為PmSpr288在生物活性多肽生產(chǎn)中的應用提供了理論依據(jù)。

表1 鰱魚肌肉蛋白水解物中多肽的分子量分布

Conclusion

本研究獲得了一種對魚肉蛋白具有良好水解性能的低溫堿性蛋白酶（PmSpe288）。該酶與魚肉肌動蛋白和肌球蛋白的結(jié)合過程很大程度上是通過氫鍵進行的，這有助于底物蛋白的水解。PmSpr288制備的鰱魚水解液含有大量的低分子量肽，具有良好的抗氧化活性。因此，考慮到生物技術或生物制品中對性能良好的酶的需求日益增長，本文的研究結(jié)果將為其在生產(chǎn)生物活性肽的實際應用，如從魚中生產(chǎn)抗氧化肽、降血壓肽的研究提供理論基礎。

第一作者

冷偉軍，江蘇大學食品與生物工程學院2021屆博士研究生，研究方向為食品微生物與酶工程，碩博師從高瑞昌教授，目前以第一作者在Food Science and Human Wellness, Journal of the Science of Food and Agriculture, Foods等期刊發(fā)表研究型論文SCI 3篇，申請中國發(fā)明專利1項。

通信作者

高瑞昌，江蘇大學食品與生物工程學院教授，博導。國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系崗位科學家，江蘇省“333”、“六大人才高峰”高層次人才，江蘇大學食品生物工程與智能裝備方向帶頭人，中國生物工程學會理事，中國食品科技學會青年工作委員會委員。長期從事食品蛋白質(zhì)加工與綜合利用、水產(chǎn)食品組分與營養(yǎng)功效和食品風味化學等領域研究，主持與參與國家自然科學基金等項目20多項。Trends in Food Science & Technology、Critical Reviews in Food Science and Nutrition、Journal of Agricultural and Food Chemistry，Food Chemistry，Food & Function發(fā)表SCI論文100多篇。授權(quán)國家發(fā)明專利17件，申請國家發(fā)明專利38件，授權(quán)美國、日本專利各1件；獲江蘇省科技進步獎等省部級和市廳級獎勵5項。《Food Biotechnology International》編委、《未來食品科學》編委、《食品科學》編委和《肉類研究》編委。

Systematic functional analysis and potential application of a serine protease from cold-adapted Planococcus bacterium

Weijun Leng^a, Xiaoyun Wu^a, Xianghui Qi^a, Hongying Liu^b, Li Yuan^a,*, Ruichang Gao^a,*

^a School of Food and Biological Engineering, Jiangsu University, Zhenjiang 212013, China

^b Ocean College of Hebei Agriculture University, Qinhuangdao 066000, China

*Corresponding authors.

Abstract

In this study, a gene encoding serine protease (PmSpr288) from cold-adapted bacterium, namely Planococcus maritimus XJ11, was cloned and overexpressed in Escherichia coli BL21 (DE3). Bioinformatics analysis revealed that PmSpr288 belongs to serine protease S8 superfamily with a classical catalytic triad comprised by the Asp49, His86 and Ser251. Moreover, PmSpr288 was found to be active over broad alkaline pH and low-moderate temperature, and exhibited wide range of protein substrate specificity. In addition, PmSpr288 was able to hydrolyze the meat proteins actin and myosin, and molecular docking results suggested that the crucial interaction between PmSpr288 and actin/myosin complexes was mainly occupied by hydrogen bonds. The muscle protein hydrolysates of silver carp prepared by PmSpr288 was shown to have antioxidant activity via DPPH radical scavenging assay, which presented an IC₅₀ valve of 1.309 mg/mL. In conclusion, these characteristics imply that PmSpr288 has potential biotechnological application prospect for the production of bioactive peptides.

Reference:

LENG W J, WU X Y, QI X H, et al. Systematic functional analysis and potential application of a serine protease from cold-adapted Planococcus bacterium[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1751-1761. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.025.