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Introduction

食品過敏原的快速準(zhǔn)確檢測對食品安全至關(guān)重要。在170種過敏性食物中，花生和大豆會引起約90%的過敏癥狀，例如血壓升高、呼吸困難、咳嗽、哮喘，甚至有休克和死亡的風(fēng)險。花生和大豆是兩種最危險的食物過敏原，它們的普遍性、持久性和嚴(yán)重性不容小覷。與牛奶和雞蛋等其他高過敏性食物相比，花生引起的過敏通常是終身的。大豆也很容易引起過敏。全世界約0.3%的成年人和13%的兒童對大豆過敏。因此，開發(fā)一種敏感、特異的花生、大豆等植物過敏原檢測方法具有重要意義。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）的基本檢測原理是：在靶標(biāo)存在的情況下，根據(jù)靶標(biāo)序列六個特異區(qū)域設(shè)計(jì)的引物（四條或者六條）在Bst DNA聚合酶的鏈置換作用以及聚合作用下進(jìn)行反應(yīng)，在一個小時內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量擴(kuò)增。LAMP方法具有極高的特異性及靈敏度，而且所需設(shè)備簡單、反應(yīng)時間短，在病毒、細(xì)菌、過敏原等檢測領(lǐng)域受到廣泛應(yīng)用。LAMP技術(shù)雖應(yīng)用廣泛，但在擴(kuò)增過程中易出現(xiàn)引物二聚體及引物錯配，產(chǎn)生假陽性結(jié)果。

Cu-TCPP納米片是一種以銅離子（金屬節(jié)點(diǎn)）和四（4-羧基苯基）卟啉為有機(jī)配體的2D-MOF納米片，具有良好的生物相容性與可降解性。Cu-TCPP納米片還具有高比表面積與大量的表面活性位點(diǎn)等優(yōu)異的特性，對熒光具有良好的猝滅能力，可以有效降低傳感器的噪聲，提高傳感靈敏度。在這篇文章中，首次利用Cu-TCPP納米片對單鏈DNA的吸附作用，將納米片加入LAMP擴(kuò)增體系中抑制非特異性擴(kuò)增，建立了具有高特異性的基于Cu-TCPP納米片的LAMP檢測方法（Cu-TCPP@LAMP），并將該方法用于檢測花生與大豆過敏原基因。

圖1 Cu-TCPP@LAMP系統(tǒng)擴(kuò)增反應(yīng)示意圖

Results and Discussion

Cu-TCPP納米片對引物的吸附作用

將Cu-TCPP納米片與花生過敏原LAMP引物進(jìn)行孵育，每隔10 min測量一次納米片的紫外吸光度值，圖2A結(jié)果顯示，在Cu-TCPP納米片溶液中加入單鏈引物后，其吸收峰發(fā)生紅移，并且隨著混合時間的延長，紅移后的吸收峰值逐漸增強(qiáng)，表明引物可以有效吸附在Cu-TCPP納米片上。進(jìn)一步將不同濃度的Cu-TCPP納米片與標(biāo)記有熒光基團(tuán)的單鏈探針進(jìn)行孵育，并對其熒光值進(jìn)行測量。結(jié)果如圖2B所示，隨著Cu-TCPP納米片濃度的增加，單鏈探針的熒光值越來越小。Cu-TCPP納米片可以將單鏈探針吸附在納米片表面上，致使單鏈探針的熒光發(fā)生猝滅。

圖2 Cu-TCPP納米片對引物的吸附作用

Cu-TCPP納米片添加量的篩選

向LAMP體系中加入1 μL不同濃度的Cu-TCPP納米片后對花生和大豆過敏原基因進(jìn)行檢測。圖3顯示，當(dāng)檢測花生和大豆的LAMP體系中分別含有900 ng 和1400 ng的Cu-TCPP納米片時，LAMP體系具有良好的擴(kuò)增且沒有非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。這一結(jié)果在不同合成批次的Cu-TCPP納米片也保持一致。

圖3 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)中Cu-TCPP納米片添加量的篩選

擴(kuò)增反應(yīng)溫度的篩選

因?yàn)樵诮?jīng)典反應(yīng)體系中增加了Cu-TCPP納米片，反應(yīng)溫度對被Cu-TCPP吸附的引物擴(kuò)增效率也可能產(chǎn)生意想不到的影響。圖4A和B顯示63 ℃時熒光強(qiáng)度最高，但對于花生和大豆兩種不同的過敏原，希望能夠建立一種通用的反應(yīng)溫度，以便于操作人員和機(jī)器的識別。圖4C比較了兩種不同對象間不同反應(yīng)溫度下Ct值距離的遠(yuǎn)近，65 ℃的反應(yīng)溫度下兩者的Ct值差值最小，是符合期望的反應(yīng)溫度。

圖4 Cu-TCPP@LAMP擴(kuò)增溫度的篩選

鎂離子濃度的篩選

鎂離子的濃度對酶和引物的擴(kuò)增效率至關(guān)重要。圖5顯示6 mmol/L的Mg²⁺確實(shí)是個不錯的選擇。

圖5 Cu-TCPP@LAMP鎂離子濃度的篩選

引物濃度的篩選

為了讓添加的Cu-TCPP納米片能有效吸附體系中的引物，減小引物二聚體產(chǎn)生的可能。從引物濃度下手看看體系中不同濃度引物會帶來怎么樣的結(jié)果：0.01 nmol/L的引物已經(jīng)不能引發(fā)擴(kuò)增，而超過0.2 nmol/L的引物則可能導(dǎo)致了二聚體的產(chǎn)生。

圖6 Cu-TCPP@LAMP引物濃度的篩選

Conclusion

Cu-TCPP@LAMP方法也成功通過了本設(shè)計(jì)的針對特異性、重復(fù)性和靈敏度的測試。這一方法能檢測出最少5 ng/μL的花生過敏原以及10 ng/μL的大豆過敏原。但過敏原檢測往往面對的是復(fù)雜的深加工食品，使用Cu-TCPP@LAMP方法檢測了市面上能夠獲得的含有花生和大豆的各類深加工食品，單盲測試中所有含有花生和大豆的食品均被檢出，展示出Cu-TCPP@LAMP方法強(qiáng)大的應(yīng)用潛能。

圖7 使用Cu-TCPP@LAMP方法檢測實(shí)際商品

表1 使用Cu-TCPP@LAMP方法檢測市售產(chǎn)品的測試結(jié)果

第一作者

高家樂，男，理學(xué)碩士在讀。主要研究方向?yàn)閯游镆卟　⒑怂釞z測方法的開發(fā)及應(yīng)用研究。

孫曉東，男，藥物分析學(xué)博士，碩士生導(dǎo)師。主要從事基于新材料的分離分析方法和核酸檢測方法的開發(fā)及應(yīng)用研究。現(xiàn)為中國藥理學(xué)會分析藥理學(xué)會青年委員，寶山科協(xié)委員。主持和參與國家自然基金青年項(xiàng)目、國家自然基金面上項(xiàng)目、上海市揚(yáng)帆計(jì)劃項(xiàng)目、上海市高校青年教師培養(yǎng)資助計(jì)劃（重點(diǎn)推薦）、江蘇省自然科學(xué)基金等課題多項(xiàng)。以第一作者或通訊作者發(fā)表SCI論文16篇，代表性論文發(fā)表在Separation and Purification Technology、Microchimica Acta、Microchemical Journal、Journal of Chromatography A、Analytical and Bioanalytical Chemistry、Electrophoresis等雜志上。

通信作者

陳沁，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，上海市植物生理學(xué)會副理事長，校研究生院招生辦公室主任，曾任上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副院長。主要從事生化與分子生物學(xué)相關(guān)交叉領(lǐng)域的研究，包括1）過敏原的檢測方法及致敏機(jī)理研究；2）II型糖尿病治療藥物的發(fā)現(xiàn)機(jī)理研究；3）動物疫病和食品安全預(yù)警方法的研究等。曾獲上海市育才獎、寶鋼優(yōu)秀教師獎、國家質(zhì)檢總局科技興檢獎、上海大學(xué)三八紅旗手、上海大學(xué)青年教師教學(xué)競賽三等獎、上海大學(xué)教學(xué)名師等。主持和參與科技部、國家自然科學(xué)基金、上海市科委、教委和農(nóng)委科研項(xiàng)目及橫向項(xiàng)目20余項(xiàng)。先后在Food Chemistry，European Journal of Medicinal Chemistry等專業(yè)期刊上發(fā)表論文100多篇，申請專利10項(xiàng)，授權(quán)專利2項(xiàng)；擔(dān)任NOTULAE BOTANICAE HORTI AGROBOTANICI雜志的編委。

方雪恩，男，博士，復(fù)旦大學(xué)化學(xué)系分析化學(xué)副教授。主要從事微流控芯片系統(tǒng)和病原微生物核酸分子恒溫?cái)U(kuò)增等領(lǐng)域的工作。曾獲上海浦江人才項(xiàng)目資助、上海市優(yōu)秀技術(shù)帶頭人稱號。

Ultrathin metal-organic framework nanosheets (Cu-TCPP)-based isothermal nucleic acid amplification for food allergen detection

Jiale Gao^a,1, Xiaodong Sun^b,1, Yongxin Liu^a, Bing Niu^a, Qin Chen^a,*, Xueen Fang^c,*

^a Shanghai Key Laboratory of Bio-Energy Crops, School of Life Sciences, Shanghai University, Shanghai 200444, China

^b Shanghai Engineering Research Center of Organ Repair, School of Medicine, Shanghai University, Shanghai 200444, China

^cDepartment of Chemistry and Institutes of Biomedical Sciences, Fudan University, Shanghai 200433, China

¹ Both authors contributed equally.

*Corresponding authors.

Abstract

The rapid and accurate detection of peanuts and soybeans allergen is important to the food safety. In this study, Cu-TCPP nanosheet, a kind of ultra-thin metal-organic framework (MOF) was synthesized and applied in loop-mediated isothermal amplification (named Cu-TCPP@LAMP), which can inhibit the non-specific amplification by absorbing and precise temperature releasing of single primer. As thus, Cu-TCPP@LAMP can achieve high sensitivity and specific amplification of the target gene. As a result, peanut and soybean allergens genes contained in food were successfully detected with a favorable detection sensitivity (5 ng/μL for peanuts and 10 ng/μL for soybeans) and reliable repeatability (The coefficient of variation was 3.38% for peanuts and 3.33% for soybeans). Moreover, the established method was utilized for detection of several commercial products, and had a high consistency with the standard method. Apart from food allergens, this novel assay can be widely used in other areas, such as pathogen detection, tumor nucleic acid detection and so on.

Reference:

GAO J L, SUN X D, LIU Y X, et al. Ultrathin metal-organic framework nanosheets (Cu-TCPP)-based isothermal nucleic acid amplification for food allergen detection[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1788-1798. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.031.