FSHW | 酶解技術(shù)助力蜂王漿高值化利用-酶解對蜂王漿蛋白結(jié)構(gòu)及抗氧化性能的影響
2023-09-27作者：來源：責(zé)任編輯：食品界
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蜂王漿是工蜂分泌的漿狀物質(zhì)，因其營養(yǎng)和功能活性而受到廣泛關(guān)注。蛋白質(zhì)是蜂王漿的重要組成成分，占蜂王漿的9%～18%，富含豐富且均衡的必需氨基酸，被視為蜂王漿中的獨(dú)特的生物活性成分。蜂王漿蛋白質(zhì)主要由王漿主蛋白構(gòu)成，約占82%～90%，具有免疫調(diào)節(jié)、降壓、抗炎、抗菌等多種生物活性。 據(jù)報(bào)道，酶解技術(shù)可以通過改變蛋白質(zhì)性質(zhì)，以獲得更高的營養(yǎng)及功能活性。目前已有研究主要集中于蜂王漿蛋白水解物的制備及應(yīng)用，如蛋白酶-N、胃蛋白酶、胰酶和木瓜蛋白酶所制備的蜂王漿蛋白水解液，在體外和體內(nèi)均顯示出相對較強(qiáng)的抗氧化活性，可能是由于酶解增加了生物活性肽的數(shù)量和種類。然而，由于目前研究中水解時(shí)間差異較大，難以確定酶解時(shí)間與水解度的聯(lián)系。另一方面，以往研究主要集中于水解產(chǎn)物的生物活性，而對其結(jié)構(gòu)特征的研究較少，因此難以建立酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。此外，蛋白酶是水解蛋白質(zhì)的主要手段之一，其中堿性蛋白酶是一種來自地衣芽孢桿菌的絲氨酸內(nèi)肽酶，被視為獲得生物活性肽的較為高效的蛋白酶之一，目前僅有少數(shù)研究將其用于制備蜂王漿蛋白來源的抗氧化肽。因此，應(yīng)用堿性蛋白酶酶解蜂王漿蛋白，并探究水解液的結(jié)構(gòu)與功能特性很有意義。 浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院李珊珊副研究員、胡福良教授和愛爾蘭農(nóng)業(yè)部Teagasc國家食品研究中心馬曉彬博士等在本文采用堿性蛋白酶水解蜂王漿蛋白來獲得生物活性肽，通過比較不同水解度的酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征和體外抗氧化活性，最終確定蜂王漿蛋白生物活性肽生產(chǎn)的最佳水解時(shí)間，為蜂王漿蛋白酶解條件的選擇、生物活性水解產(chǎn)物的設(shè)計(jì)提供參考，并為蜂王漿蛋白酶解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系提供理論依據(jù)。 為了構(gòu)建有效的蜂王漿蛋白酶解技術(shù)，研究了蜂王漿蛋白經(jīng)堿性蛋白酶水解，在不同酶解時(shí)間的水解度。如圖1所示，蜂王漿蛋白隨著酶解時(shí)間的增加，水解度不斷增加，在8 h時(shí)達(dá)到最大。在最初的1 h內(nèi)，水解度增加最顯著，達(dá)到15.19%，在之后的7 h內(nèi)，水解度逐漸增加至23.91%。這說明高效酶解能夠在短時(shí)間內(nèi)完成，并且不能維持較長時(shí)間。一方面，在初期，溶解性較差的蜂王漿蛋白轉(zhuǎn)化為可溶性形式，促進(jìn)酶分子向底物滲透，加速酶促反應(yīng)。另一方面，堿性蛋白酶的反應(yīng)穩(wěn)定性較差，在長時(shí)間的反應(yīng)中酶活性降低；并且隨著反應(yīng)的進(jìn)行，蛋白底物中的可達(dá)裂解位點(diǎn)減少。隨著越來越多的蜂王漿蛋白被降解為小肽，酶分子與合適底物的接觸頻率降低，從而阻礙了酶促反應(yīng)。
本文選擇了5個(gè)具有代表性的水解度：5.34%（RJPH5，0 min），11.65%（RJPH12，15 min），15.19%（RJPH15，1 h），21.38%（RJPH21，5 h）和23.91%（RJPH24，8 h），進(jìn)行抗氧化活性和結(jié)構(gòu)特性的解析（圖2）。與蜂王漿蛋白（RJPH5）相比，所有酶解產(chǎn)物（RJPH12、RJPH15、RJPH21和RJPH24）均表現(xiàn)出更高的抗氧化活性，這表明堿性蛋白酶水解是增強(qiáng)蜂王漿蛋白抗氧化活性的有效方法。這可能是堿性蛋白酶水解蜂王漿蛋白可以釋放出更多的生物活性肽，從而提高蜂王漿蛋白水解物的抗氧化活性。另一方面，抗氧化活性呈現(xiàn)水解度依賴不斷增加，并且在5 h內(nèi)抗氧化活性增加較快，5 h后增加趨勢開始趨于平緩，說明5h后，堿性蛋白酶的酶活性降低，進(jìn)而降低了生物活性肽的生成效率。
為了進(jìn)一步探明蜂王漿蛋白抗氧化活性增加的原因，通過分子量分布、傅里葉變換紅外光譜、二級和三級結(jié)構(gòu)、表面疏水性和表面形態(tài)學(xué)等指標(biāo)，解析了蜂王漿蛋白水解液的結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，隨著水解度的增加，蜂王漿蛋白水解液的分子量顯著降低（圖3），表明堿性蛋白酶有效地水解了肽鍵，將大分子裂解為更小的片段，但是水解也是有限度的，進(jìn)一步延長水解時(shí)間及增大水解度并不能將大分子量組分進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為更小分子量組分。傅里葉變換紅外光譜顯示蜂王漿蛋白的初級結(jié)構(gòu)并未改變（圖4），而二級結(jié)構(gòu)分析表明，酶解使得蜂王漿蛋白內(nèi)部的α-螺旋減少，而β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加。隨著水解度的增加，蜂王漿蛋白水解液的表面疏水性和內(nèi)源熒光密度顯著降低（圖5和圖6），并且內(nèi)源熒光發(fā)生了紅移（圖5）。蜂王漿蛋白水解液表面形態(tài)從緊密的片狀結(jié)構(gòu)逐漸被水解成疏松的微小顆粒（圖7）。這些結(jié)果表明，適度酶解可以使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加伸展，破壞肽鍵，暴露出更多酶的結(jié)合位點(diǎn)，從而進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的水解，釋放更多的生物活性肽，從而增強(qiáng)水解物的抗氧化活性。
本文比較了水解程度對蜂王漿蛋白結(jié)構(gòu)與功能的影響，研究發(fā)現(xiàn)蜂王漿蛋白水解液的水解度呈現(xiàn)時(shí)間依賴性不斷增加，抗氧化活性呈現(xiàn)水解度依賴不斷增加。蛋白結(jié)構(gòu)方面，隨著水解度的增加，蛋白質(zhì)分子量降低，初級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，而內(nèi)部的α-螺旋減少，β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)增加。與蜂王漿蛋白相比，蜂王漿蛋白水解液的表面疏水性和內(nèi)源熒光密度顯著降低，內(nèi)源熒光發(fā)生紅移，其表面形態(tài)也從較大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為更小的蛋白質(zhì)片段。但是也許是由于堿性蛋白酶效率隨著反應(yīng)時(shí)間延長而降低，這些變化在水解度大于20%時(shí)呈現(xiàn)不顯著的變化。綜合酶解效率和產(chǎn)量，蜂王漿蛋白的最佳酶解時(shí)間為5 h。 
李珊珊，女，農(nóng)學(xué)博士，浙江大學(xué)特聘副研究員。主要研究方向?yàn)榉洚a(chǎn)品功能、加工與質(zhì)量控制。一直從事功能性食品與人類健康的研究，圍繞蜂產(chǎn)品（蜂王漿、蜂膠、蜂花粉等）的特點(diǎn)，利用分子和細(xì)胞生物學(xué)、分析化學(xué)、組學(xué)結(jié)合生信分析等技術(shù)，建立蜂產(chǎn)品的質(zhì)量控制技術(shù),系統(tǒng)解析蜂產(chǎn)品中活性成分改善人體健康的分子機(jī)制。主持國家自然科學(xué)基金、中國博士后科學(xué)基金特別資助和面上資助等科研項(xiàng)目5項(xiàng)。近5年來，在國際權(quán)威期刊發(fā)表論文20余篇，其中第一作者身份在Food Chemistry, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Food Research International, Food & Function等雜志發(fā)表。
胡福良，男，理學(xué)博士，教授，博士生導(dǎo)師，國務(wù)院政府特殊津貼專家。研究方向?yàn)槊鄯洹⒎洚a(chǎn)品及功能性食品科學(xué)。現(xiàn)任浙江大學(xué)蠶蜂研究所所長，動物科學(xué)學(xué)院學(xué)術(shù)委員會主任；兼任中國養(yǎng)蜂學(xué)會副理事長，中國蜂產(chǎn)品協(xié)會顧問，浙江省蜂業(yè)學(xué)會理事長，國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系產(chǎn)品加工研究室主任、崗位科學(xué)家。先后主持國家自然科學(xué)基金、科技部、教育部、浙江省等各級各類課題60余項(xiàng)；獲國家技術(shù)發(fā)明二等獎(jiǎng)2項(xiàng)、國家科技進(jìn)步三等獎(jiǎng)1項(xiàng)、省部級獎(jiǎng)6項(xiàng)；獲得授權(quán)國家發(fā)明專利40項(xiàng)；制訂國家及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)10項(xiàng)；主編、副主編著作10部；發(fā)表學(xué)術(shù)論文400余篇。
馬曉彬，女，工學(xué)博士，愛爾蘭農(nóng)業(yè)部Teagasc國家食品研究中心瑪麗居里博士后。主要研究方向?yàn)槭称访附狻⒌鞍踪|(zhì)與多糖相互作用及食品組分超聲波加工。主持歐盟瑪麗居里學(xué)者項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金、中國博士后科學(xué)基金等科研項(xiàng)目4項(xiàng)。近5年來在Food Hydrocolloides, Food Chemistry, Ultrasonics Sonochemistry, Carbohydrate Polymers 等國際權(quán)威期刊發(fā)表論文30余篇。
Structural and antioxidative properties of royal jelly protein by partial enzymatic hydrolysis
Shanshan Lia, Lingchen Taoa, Shiqin Penga, Xinyu Yua, Xiaobin Mab,*, Fuliang Hua,*
a Key laboratory of silkworm and bee resource utilization and innovation of Zhejiang Province, College of Animal Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China
b Teagasc Food Research Centre, Moorepark, Fermoy, Co. Cork P61 C996, Ireland
*Corresponding authors.
Abstract
The objective of this study was to investigate the structural and antioxidative properties of royal jelly protein (RJP) at different degrees of hydrolysis (DH) by partial enzymatic hydrolysis. RJP was hydrolyzed by alcalase for 0 min, 15 min, 1 h, 5 h and 8 h to obtain hydrolysates at DH of 5.34%, 11.65%, 15.19%, 21.38% and 23.91%, respectively. With the increased DH, the RJP hydrolysates showed elevated antioxidative activities. The molecular weight of RJP hydrolysates was significantly decreased but their primary backbone kept unchanged. Analysis of circular dichroism spectra revealed that the enzymolysis reduced the content of α-helix but increased the contents of β-sheet, β-turn and random coil. Meanwhile, the surface hydrophobicity and fluorescence intensity of RJP hydrolysates were decreased and a red shift occurred. As the enzymolysis continued, the surface morphology of RJP was gradually changed from a sheet-like structure into microparticles. Changes in antioxidative activities and structures generally followed a DH-dependent manner, however these changes became insignificant for samples at DH beyond 20%. Taking into consideration of both effectiveness and productivity, the optimum enzymatic duration was determined at 5 h.
LI S S, TAO L C, PENG S Q, et al. Structural and antioxidative properties of royal jelly protein by partial enzymatic hydrolysis[J]. Food Science and Human Wellness, 2023, 12(5): 1820-1827. DOI:10.1016/j.fshw.2023.02.046.
