原標(biāo)題：血紅蛋白微生物發(fā)酵法合成研究進(jìn)展

近日，Trends in Biotechnology在線發(fā)表了江南大學(xué)未來食品科學(xué)中心和生物工程學(xué)院陳堅院士團(tuán)隊的綜述Recent advances in the microbial synthesisof hemoglobin。趙鑫銳副研究員為第一作者，周景文教授為通訊作者，論文作者還包括陳堅教授和堵國成教授。

　　血紅蛋白是一類存在于原核和真核細(xì)胞中的以血紅素為輔基的含鐵金屬蛋白，在生物體內(nèi)具有運(yùn)輸和儲存氧、調(diào)節(jié)胞內(nèi)pH值、調(diào)控生理代謝等諸多重要功能。近年來，血紅蛋白已經(jīng)被應(yīng)用于急診醫(yī)學(xué)（作為無細(xì)胞氧載體）、醫(yī)療保健（作為鐵補(bǔ)給劑）、食品加工（食品級著色和調(diào)味劑）等領(lǐng)域。但血紅蛋白的獲取依然需要依靠從血液或植物組織中提取，提取法不僅費(fèi)時低效、并且所用化學(xué)試劑還易造成環(huán)境污染。因此，以微生物細(xì)胞工廠為平臺來合成不同來源的血紅蛋白已經(jīng)成為近年來的研究熱點(diǎn)。

　　在NCBI的GeneBank數(shù)據(jù)庫中已有超過141110條的血紅蛋白基因編碼序列，在EMBL蛋白數(shù)據(jù)庫中已有超過84424條的血紅蛋白氨基酸序列，在PDB蛋白晶體數(shù)據(jù)庫中也已經(jīng)有725條血紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，但現(xiàn)階段其中只有15種不同來源（人、大豆、鱷魚等）的血紅蛋白可由9種有限的微生物（大腸桿菌、釀酒酵母、枯草芽孢桿菌等）合成。根據(jù)對現(xiàn)有血紅蛋白氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，發(fā)現(xiàn)不同來源的血紅蛋白及其亞基分為幾類：動物來源血紅蛋白α亞基、β亞基以及其他類型亞基，植物來源單亞基血紅蛋白、微生物來源血紅蛋白（圖1）。因此，可以綜合應(yīng)用目前越來越成熟的代謝工程和合成生物學(xué)策略，開發(fā)出有效且穩(wěn)定的血紅蛋白微生物合成方法，來滿足對人、大豆、透明顫菌等不同物種血紅蛋白的大規(guī)模應(yīng)用的需求。

　　血紅素是血紅蛋白執(zhí)行其生理功能所必須的輔基，要想高效合成血紅蛋白首先需要提高胞內(nèi)血紅素的供給水平。在自然界中血紅素的合成主要通過C4和C5兩種途徑（圖2），通過強(qiáng)化C4途徑并補(bǔ)加甘氨酸和琥珀酸作為底物或強(qiáng)化抗反饋抑制的C5途徑都可以增加胞內(nèi)血紅素前體5-氨基酮戊酸（ALA）的含量。在此基礎(chǔ)上繼續(xù)強(qiáng)化并模塊化改造血紅素合成的下游途徑，可在大腸桿菌中不添加底物的情況下實(shí)現(xiàn)115.5±2.3mg/L血紅素的合成。此外，由于胞內(nèi)過高含量的血紅素會顯著抑制菌體的生長，利用血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可以實(shí)現(xiàn)超過60%血紅素的分泌合成，以減輕血紅素對細(xì)胞的毒性作用。

　　在提高血紅素供給水平的基礎(chǔ)上，利用大腸桿菌、酵母等微生物宿主合成不同來源血紅蛋白已獲得成功。由于代謝改造成熟和培養(yǎng)成本低廉，目前超過70％的血紅蛋白均由大腸桿菌合成。首先為了增強(qiáng)大腸桿菌中血紅蛋白的可溶性，密碼子優(yōu)化、啟動子和載體的適配組合、以及蛋白促溶標(biāo)簽均已被成功應(yīng)用來避免包涵體的形成；其次為了增強(qiáng)動物來源血紅蛋白α亞基的表達(dá)量，α亞基編碼基因的串聯(lián)表達(dá)和穩(wěn)定輔因子AHSP的共表達(dá)也已被用于提高α亞基的穩(wěn)定型；此外由于大腸桿菌宿主中血紅素的合成和運(yùn)輸能力較弱，可以通過引入志賀假單胞菌的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)并在胞外添加高濃度的血紅素，以增加細(xì)胞內(nèi)血紅素水平（圖3）。在初步獲得血紅蛋白的基礎(chǔ)上，還可以進(jìn)一步通過：將人源血紅蛋白α亞基和牛源血紅蛋白β亞基相結(jié)合，開發(fā)出一種自聚合的人牛雜源血紅蛋白（180-500kDa聚合物）來延長商業(yè)化無細(xì)胞氧載體產(chǎn)品在血液中的半衰期；在宿主中共表達(dá)甲硫氨酸氨基肽酶以加速血紅蛋白N末端蛋氨酸殘基的正確切除；優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)溫度等發(fā)酵條件來提高血紅蛋白的產(chǎn)量。

　　除大腸桿菌之外，釀酒酵母、畢赤酵母等酵母菌株也是合成血紅蛋白的高效平臺。但在前期研究中，釀酒酵母合成血紅蛋白的產(chǎn)量較低，近幾年通過優(yōu)化血紅蛋白α和β亞基之間表達(dá)水平的比率、強(qiáng)化血紅素合成途徑、敲除轉(zhuǎn)錄因子Hap1p改造氧氣傳感途徑（圖3），人源血紅蛋白的最高含量可以達(dá)到細(xì)胞中總可溶性蛋白的7％。畢赤酵母是目前生產(chǎn)商業(yè)化大豆血紅蛋白的高效宿主，所得大豆血紅蛋白可添加到新型人造肉產(chǎn)品中來模擬真肉的肉色和風(fēng)味。Impossible Foods公司開發(fā)的可以商業(yè)化合成大豆血紅蛋白的畢赤酵母菌株，已經(jīng)獲得了FDA的許可并在多個國家申請了專利。在該菌株中血紅素合成所需的八種酶被分為三個模塊，并分別用甲醇誘導(dǎo)的AOX1啟動子進(jìn)行了強(qiáng)化表達(dá)；此外兩個拷貝的大豆血紅蛋白的基因和轉(zhuǎn)錄激活因子Mxr1p也被整合到基因組中；最后，通過優(yōu)化高密度發(fā)酵條件，實(shí)現(xiàn)了大豆血紅蛋白的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)（圖3）。

　　目前利用微生物來合成血紅蛋白雖然已經(jīng)獲得了成功，但大部分血紅蛋白的產(chǎn)量還較低，這對在生產(chǎn)中應(yīng)用重組血紅蛋白提出了重大挑戰(zhàn)。在未來的研究中可以采用新的策略來進(jìn)行強(qiáng)化菌株的合成能力（圖4）：首先可以通過深度學(xué)習(xí)的方法發(fā)現(xiàn)編碼未知的具有特殊功能或特性的血紅蛋白基因，例如具有高溫不易變色特性的三葉草血紅蛋白等；其次應(yīng)繼續(xù)尋找血紅素合成途徑中的限速步驟，并應(yīng)用蛋白質(zhì)支架等策略解除這些步驟之間的空間隔離；再次應(yīng)抑制胞內(nèi)血紅素合成途徑中的副產(chǎn)物和血紅素加氧酶對血紅素的降解；最后由于血紅素對細(xì)胞有毒性作用，并且血紅素合成途徑中酶的過度表達(dá)會增加宿主的代謝負(fù)擔(dān)，因此應(yīng)用血紅素感應(yīng)器來實(shí)現(xiàn)血紅素合成和血紅蛋白表達(dá)之間的代謝平衡是突破血紅蛋白合成瓶頸的關(guān)鍵。

　　本綜述得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2019YFA0906400）、國家自然科學(xué)基金（31900067）、“輕工技術(shù)與工程1”國家一流學(xué)科項(xiàng)目（LITE2018-08）的資助，以“Recentadvances in the microbial synthesis of hemoglobin”為題發(fā)表在期刊Trendsin Biotechnology上（Trendsin Biotechnology, 2021, 39（3）， 286-297, https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0167779920302262）。

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