利用脫毒的慢病毒進(jìn)行過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建，構(gòu)建完成的載體通過(guò)多引物PCR驗(yàn)證和測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果良好，序列無(wú)突變發(fā)生。

在明確轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度為25時(shí)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞效率最高的基礎(chǔ)上，利用嘌呤霉素進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞藥篩，去除假陽(yáng)性細(xì)胞。連續(xù)傳代驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)組的細(xì)胞已經(jīng)突破生理極限，突破了“Hay flick”界限（細(xì)胞最大分裂次數(shù)），證明本研究中的細(xì)胞永生化誘導(dǎo)取得初步成功。

流式細(xì)胞術(shù)鑒定陽(yáng)性細(xì)胞純化程度

分別在誘導(dǎo)細(xì)胞加入嘌呤霉素的第2，4，6天時(shí)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞鑒定，檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的藥篩效率，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，陽(yáng)性細(xì)胞的比例不斷上升，第6天時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞比例為100%（存在極少數(shù)的陰性細(xì)胞在圈門外，比例接近于0），陰性細(xì)胞已通過(guò)嘌呤霉素全部篩除。

細(xì)胞核型分析

對(duì)誘導(dǎo)后傳代50代的細(xì)胞進(jìn)行染色體核型分析發(fā)現(xiàn)，1號(hào)染色體中央著絲粒和次縊痕染色深，2號(hào)染色體短臂有4條深帶，長(zhǎng)臂有6～7條深帶，分3個(gè)區(qū)；3號(hào)染色體著絲粒染色濃，在短臂和長(zhǎng)臂的中端各有1條明顯寬闊的淺帶；其它染色體從形態(tài)、長(zhǎng)度和臂比上看均未產(chǎn)生顯著的異變。

在永生化誘導(dǎo)的細(xì)胞中hnRNP A2蛋白的表達(dá)與端粒酶活性呈正相關(guān)，hnRAP A2的表達(dá)促進(jìn)了端粒的延長(zhǎng)。此外，在成體細(xì)胞中，端粒酶是無(wú)法被檢測(cè)到的，而在本誘導(dǎo)細(xì)胞株中，可以檢測(cè)到端粒酶的表達(dá)，證明細(xì)胞的誘導(dǎo)成效顯著。

細(xì)胞培育肉作為一門新興科學(xué)技術(shù)，雖然研究時(shí)間相對(duì)較短，但是其作為細(xì)胞生物學(xué)、組織工程學(xué)及食品科學(xué)等多學(xué)科交叉融合的技術(shù)已經(jīng)具備深厚的研究基礎(chǔ)。在細(xì)胞培育肉研發(fā)過(guò)程中，獲得相應(yīng)的可以無(wú)限增殖的成體細(xì)胞，是解決其工業(yè)化過(guò)程中細(xì)胞來(lái)源的重要保障。

在基因水平層面，細(xì)胞永生化的方法目前主要有SV40大T抗原法、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶法、HPV16 E6法、原癌基因以及抑癌基因等方法。這些細(xì)胞永生化的方法各有利弊，作為食品科學(xué)研究，細(xì)胞培育肉使用的種子細(xì)胞首先需要排除人源因素，同時(shí)保證細(xì)胞的活性及各項(xiàng)功能，更重要的是細(xì)胞永生化的誘導(dǎo)不能干擾了各類種子細(xì)胞的正常使用，即不能引入不確定因素。

王守偉 教授級(jí)高級(jí)工程師

中國(guó)肉類食品綜合研究中心 首席科學(xué)家

北京食品科學(xué)研究院 首席科學(xué)家