領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國(guó)食品雜志社
設(shè)計(jì)人Cu,Zn-SOD酵母偏愛(ài)密碼子并化學(xué)合成，與pPIC9K連接，構(gòu)建酵母偏愛(ài)密碼子的人Cu,Zn-SOD基因真核表達(dá)載體，通過(guò)電轉(zhuǎn)化和持續(xù)加壓篩選畢赤酵母GS115高拷貝轉(zhuǎn)化子，獲得的重組高表達(dá)酵母菌株建立主種子批。經(jīng)Southern blot鑒定，基因拷貝數(shù)提高2～8倍，活性檢測(cè)顯示提高2～4倍。重組菌的目的基因拷貝數(shù)與表達(dá)產(chǎn)物呈正相關(guān)；表達(dá)產(chǎn)物為二聚體，其分子質(zhì)量為40kD左右，低糖基化，均為分泌表達(dá)。Western blot法分析，對(duì)Cu,Zn-SOD抗體具有特異性反應(yīng)。轉(zhuǎn)化子在培養(yǎng)16h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，24h后進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期；轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)20h左右進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)最為合適。高拷貝的3株重組菌經(jīng)50次傳代后插入的目的基因保持穩(wěn)定；Cu,Zn-SOD轉(zhuǎn)化子用正交試驗(yàn)篩選搖瓶的誘導(dǎo)表達(dá)條件，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)，Cu,Zn-SOD表達(dá)上清最高活性大于600U/mL。確立最適搖瓶培養(yǎng)條件為pH6.0、30℃、體積分?jǐn)?shù)1.5%甲醇誘導(dǎo)72h測(cè)得上清的目的蛋白表達(dá)最好，表明構(gòu)建了高表達(dá)菌株。
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