針對(duì)編碼副溶血弧菌的特異性基因和主要毒力基因tlh、tdh、ureR進(jìn)行引物及探針設(shè)計(jì),通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)條件,建立基于Taqman探針快速檢測(cè)副溶血弧菌毒力基因的三重實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction,real-time PCR)方法。利用10 株副溶血弧菌和22 株非副溶血弧菌對(duì)設(shè)計(jì)的引物及探針進(jìn)行特異性驗(yàn)證,結(jié)果表明設(shè)計(jì)的引物及探針具有很高的特異性;優(yōu)化后的引物濃度分別為tdh 0.15 μmol/L、tlh 0.15 μmol/L、ureR 0.80 μmol/L,探針濃度分別為HEX 0.50 μmol/L、FAM 0.50 μmol/L;該方法即使在高濃度的背景細(xì)菌存在下,DNA濃度與Ct值均呈良好的線性關(guān)系,檢出限為1.8×102 拷貝/mL;以完整菌細(xì)胞的懸液為模板時(shí),預(yù)變性時(shí)間為30 min,擴(kuò)增檢測(cè)效果與以基因組DNA(gDNA)為模板相當(dāng)(ΔCt<1)。本研究建立的三重real-time PCR方法能實(shí)現(xiàn)快速定量檢測(cè)副溶血弧菌,并能有效區(qū)分致病性及非致病性副溶血弧菌,為副溶血弧菌的快速定量檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供快速、靈敏、準(zhǔn)確的方法。
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