領(lǐng)學(xué)術(shù)科研之先，創(chuàng)食品科技之新
—— 中國(guó)食品雜志社
目的:利用pET質(zhì)粒原核表達(dá)體系克隆、表達(dá)阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因,表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Ni-NTA柱純化,利用α-葡萄糖苷酶分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖的特性進(jìn)行表達(dá)純化合的蛋白活性鑒定,為進(jìn)一步制備阪崎腸桿菌檢測(cè)用單克隆抗體奠定了基礎(chǔ)。方法:從阪崎腸桿菌ATCC29544標(biāo)準(zhǔn)菌株中克隆獲得阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因,連接pET22b(+)表達(dá)載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,利用不同濃度的異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)外源基因,分別檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間、不同濃度IPTG作用下表達(dá)產(chǎn)物,篩選高表達(dá)菌株。表達(dá)菌株大量培養(yǎng)后,超聲波及蛋白酶K作用破菌,Ni-NTA親和柱純化目的蛋白,純化產(chǎn)物進(jìn)行酶活性的測(cè)定。結(jié)果:克隆獲得的α-葡萄糖苷酶基因與NCBI收錄的基因序列屬等位基因,核苷酸位點(diǎn)有多處差異,氨基酸序列也有不同。構(gòu)建表達(dá)載體并誘導(dǎo)表達(dá)后,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測(cè),目標(biāo)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量約為65kD,與理論值相符。目標(biāo)蛋白量約占菌體總蛋白量的18%。同時(shí),由純化結(jié)果可以看出,以500mmol/L咪唑洗脫時(shí)的純化效果最理想,蛋白純度可達(dá)90%以上。對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行過(guò)酶活性初步檢測(cè)證明,重組的阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶能夠分解4-硝基苯基-α-D-呋喃型葡萄糖,產(chǎn)生藍(lán)綠色。結(jié)論:本研究中克隆獲得了阪崎腸桿菌α-葡萄糖苷酶基因,通過(guò)構(gòu)建pET22b(+)-Glu表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌可獲得基因重組的高表達(dá)菌株,表達(dá)產(chǎn)物具有較好的酶活性,純化后純度可達(dá)90%以上。
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