將一種DNA染料疊氮溴化乙錠(ethidium bromide monoazide,EMA)與實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)相結(jié)合,建立一種能選擇性定量檢測(cè)牡蠣中trh陽性副溶血弧菌活細(xì)胞的新方法。結(jié)果表明:使EMA成功插入死細(xì)胞DNA并且光解溶液中游離EMA的最佳曝光時(shí)間為20min;不抑制副溶血弧菌活細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最大EMA質(zhì)量濃度為2.0μg/mL;完全抑制熱致死細(xì)胞DNA擴(kuò)增的最小EMA質(zhì)量濃度為1.0μg/mL;人工污染牡蠣樣品,不經(jīng)過富集,在2.0×103~2.0×107CFU范圍內(nèi)細(xì)胞數(shù)的常用對(duì)數(shù)值與Ct值之間呈嚴(yán)格的負(fù)相關(guān)性,并且純培養(yǎng)與人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測(cè)限均為2×103CFU,即人工污染牡蠣樣品的RT-PCR檢測(cè)靈敏度為每克牡蠣樣品400個(gè)活細(xì)胞;凍融實(shí)驗(yàn)表明,在溫度低于55℃的水浴中對(duì)冷凍海產(chǎn)品進(jìn)行解凍時(shí),凍融過程對(duì)副溶血弧菌活細(xì)胞幾乎沒有影響。該方法是一種快速、靈敏且能有效鑒別并定量檢測(cè)病原活細(xì)胞的新方法。
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