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—— 中國食品雜志社
目的：采用逆轉錄微滴數(shù)字聚合酶鏈式反應（reverse transcription droplet digital polymerase chain reaction，RT-ddPCR）技術和QX200 Droplet Digital PCR System，建立一步法RT-ddPCR高靈敏快速檢測生菜中GII型諾如病毒（norovirus genegroup II，NoV GII）的方法。方法：優(yōu)化RT-ddPCR檢測NoV GII的反應體系；通過10?倍梯度稀釋的NoV GII線性陽性質粒確定RT-ddPCR的檢測范圍；利用其他常見的腸道病毒核酸（非GII型諾如病毒）作為反應模板，與NoV GII核酸同時進行RT-ddPCR，判定反應體系的特異性，并通過不同時間多次檢測樣品的方式判斷該檢測方法的穩(wěn)定性。采用ISO/TS 15216-1:2013食品中諾如病毒RNA提取方法，對人工染毒不同水平（高、中、低）的NoV GII生菜樣品進行檢測，同時研究去除抑制物前后對RT-ddPCR檢測的影響，并與逆轉錄定量聚合酶鏈式反應（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）進行檢測回收率的對比，探究RT-ddPCR在食品中NoV?GII快速與定量檢測上的發(fā)展?jié)摿εc應用前景。結果：RT-ddPCR的最高檢測限為8.47×104?copies/μL，最低檢測限為2.12?copies/μL，RT-ddPCR擴增效率為95.44%，標準曲線相關系數(shù)為0.997?3。在不同濃度人工染毒生菜樣品中，抑制物的存在對ddPCR回收率檢測結果沒有顯著性差異。在高、中染毒濃度下，抑制物對RT-qPCR與RT-ddPCR回收率檢測結果影響不顯著。低濃度下，未去除抑制物的RT-qPCR法平均回收率僅1.43%，與去除抑制物后的RT-qPCR檢測結果（平均回收率為9.71%）有顯著差異，且與RT-ddPCR的檢測結果（未去除抑制物的RT-ddPCR平均回收率為11.80%，去除抑制物后平均回收率為12.53%）存在顯著性差異。結論：生菜抑制物對RT-ddPCR的檢測影響不顯著，利用RT-ddPCR可有效測出低濃度的受污染樣品，避免用現(xiàn)有的RT-qPCR方法因抑制物帶來的“假陰性”檢測結果。本實驗建立的RT-ddPCR方法能高效、靈敏地檢測出受污染食品中NoV?GII的低病毒含量，在食源性病毒檢測中具有可觀的發(fā)展?jié)摿蛻们熬啊?/p>
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