為探究槐角苷(sophoricoside,Sop)、葛根素(puerarin,Pue)、芒果苷(mangiferin,Man)、曲酸(kojic acid,KA)對(duì)酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)的聯(lián)合抑制作用,通過聯(lián)合作用指數(shù)、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)確定協(xié)同抑制作用組合及其添加順序,借助多光譜法探究聯(lián)合作用機(jī)制。結(jié)果表明:Pue+Sop、Sop+KA、KA+Man組合發(fā)揮協(xié)同抑制作用,添加順序?yàn)門YR-Pue-Sop、TYR-Sop-KA、TYR-KA-Man。聯(lián)合作用時(shí)均發(fā)生靜態(tài)猝滅,即形成了酶-雙抑制劑三元復(fù)合物;TYR-Pue-Sop較TYR-Sop的結(jié)合常數(shù)無較大差別,結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1,說明兩者結(jié)合位點(diǎn)不同;結(jié)合常數(shù)的增加和粒徑的降低表明Sop、KA分別促進(jìn)了TYR-KA、TYR-Man的結(jié)合,使其結(jié)合更加緊密。抑制劑1的存在并沒有改變抑制劑2原有的作用力類型,TYR-Pue-Sop以靜電相互作用為主,TYR-Sop-KA以氫鍵和范德華力為主,TYR-KA-Man以疏水相互作用為主要驅(qū)動(dòng)力。紅外光譜顯示,與TYR樣品相比,TYR-Sop-KA、TYR-Pue-Sop趨于向無序化方向轉(zhuǎn)變,TYR-KA-Man的結(jié)構(gòu)更加不穩(wěn)定。差示掃描量熱法結(jié)果顯示,復(fù)合抑制劑的熱變性熔融溫度均低于單抑制劑,表明聯(lián)合抑制時(shí)TYR的熱穩(wěn)定性降低。抑制劑1使抑制劑2結(jié)合常數(shù)的增加及熱穩(wěn)定性的降低是雙抑制劑產(chǎn)生協(xié)同作用的一些原因。
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