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—— 中國食品雜志社
通過將乙醛脫氫酶2（acetaldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）與NusA-tag融合表達(dá)，以獲得能夠在大腸桿菌中可溶性表達(dá)并且具有較好活性的重組蛋白。首先，根據(jù)Aldh2的基因序列設(shè)計引物，引入EcoRI和XhoI的酶切位點，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增出Aldh2基因片段，連接到pMD19-T-simple載體，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α菌株。測序正確后，雙酶切處理，將Aldh2基因片段克隆到表達(dá)載體pET44b（＋）上NusA-tag下游的EcoRI和XhoI酶切位點之間，得到pET44b（＋）-NusA-Aldh2重組載體，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21（DE3）菌株。經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)，表達(dá)的融合蛋白具有良好的溶解性，主要存在于上清液中。融合蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件為IPTG濃度0.25 mmol/L、誘導(dǎo)溫度37 ℃、誘導(dǎo)時間3 h。重組蛋白的最適反應(yīng)溫度為37 ℃，在pH 7.0時達(dá)到最好的催化效果。不同金屬離子如Ca2＋、K＋、Na＋、Mg2＋、Mn2＋都對酶有激活作用，且Mg2＋效果最好，最佳的酶活性為1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大腸桿菌中表達(dá)時完全以無活性的包涵體形式存在，復(fù)性后得到的酶活性為1.43 U/mL。本研究通過引入NusA進(jìn)行融合表達(dá)，實現(xiàn)了ALDH2在大腸桿菌中的可溶性表達(dá)，且重組蛋白的活性優(yōu)于包涵體復(fù)性蛋白。這些結(jié)果表明利用NusA進(jìn)行融合表達(dá)是制備重組ALDH2的一個良好方法。
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