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不同誘導(dǎo)條件下的VBNC狀態(tài)副溶血弧菌的PMA-qPCR定量檢測(cè)及其呼吸活性分析
來源:食品科學(xué)網(wǎng) 閱讀量: 189 發(fā)表時(shí)間: 2017-10-10
作者: 劉羽霏,方祥,廖振林,王麗,鐘青萍
關(guān)鍵詞: 副溶血弧菌;活的非可培養(yǎng)(VBNC)狀態(tài);PMA-qPCR;流式細(xì)胞儀;激光掃描共聚焦顯微鏡
摘要:

定量檢測(cè)不同誘導(dǎo)條件下的活的非可培養(yǎng)(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)副溶血弧菌的變化情況,并對(duì)VBNC菌的呼吸活性進(jìn)行分析。采用疊氮溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)與熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qPCR)結(jié)合的技術(shù)(PMA-qPCR)定量檢測(cè)副溶血弧菌活菌數(shù)。結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀優(yōu)化傳統(tǒng)CTC(5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride)呼吸檢測(cè)法對(duì)VBNC狀態(tài)的副溶血弧菌進(jìn)行分析。結(jié)果表明PMA-qPCR檢測(cè)技術(shù)結(jié)合平板計(jì)數(shù)的方法,可用于定量檢測(cè)副溶血弧菌誘導(dǎo)過程中活菌數(shù)和可培養(yǎng)菌數(shù)的變化情況,并利用差值測(cè)定出VBNC細(xì)胞的濃度。在不同的溫度、NaCl含量和氯霉素含量的誘導(dǎo)條件下,副溶血弧菌在其中的7?種條件下在60?d內(nèi)進(jìn)入了VBNC狀態(tài)。VBNC細(xì)胞終濃度最低為5.75×102?CFU/mL,最高為1.70×105?CFU/mL。在細(xì)胞呼吸實(shí)驗(yàn)中,采用CTC與4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(4’,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)雙染法能在激光掃描共聚焦顯微鏡下清晰地觀察到VBNC細(xì)胞表面的紅色熒光,有效區(qū)分死活細(xì)胞。同時(shí)利用流式細(xì)胞儀能夠根據(jù)熒光強(qiáng)度快速區(qū)分呼吸活性呈陰性和陽性的細(xì)胞。本研究為VBNC細(xì)菌的檢測(cè)和生理特性的研究提供了新的思路和依據(jù)。

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